Journal of Zhejiang University-SCIENCE B (Biomedicine amp; Biotechnology) ISSN 1673-1581 (Print); ISSN 1862-1783 (Online)

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水稻泛素缀合酶基因（OsUbc13）的分子特性和互作研究

Ya WANG^1,2, Meng-yun XU¹, Jian-ping LIU¹, Mu-gui WANG¹, Hai-qing YIN², Ju-min TU^{dagger;Dagger;1}

(¹Institute of Crop Science, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China) (²Cereal Crops Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China)

^dagger;E-mail: jtu@zju.edu.cn

Received Oct. 24, 2013; Revision accepted May 13, 2014; Crosschecked June 24, 2014

摘要：泛素（Ub）缀合酶 Ubc13 通过催化与 Lys63 连接的多泛素链和 Ubc 变异体参与无错误的 DNA 损伤耐受性（或复制后修复）。但是，其功能在植物物种中，尤其是在单子叶植物中仍然是未知的。在这项研究中，我们克隆了一个与

Ub 结合的酶 OsUbc13，该酶与 Oryza sativa L.中的 AtUBC13B 共享 Ubc 的保守结构域，该蛋白编码 153 个氨基酸。推导的序列与其他同源物具有高度相似性。实时定量聚合酶链反应（ PCR）表明，在所有检查的组织中都可以检测到OsUbc13 转录本，其表达水平在面，雌蕊，雄蕊和叶中较高，而在根，茎和外中较低。OsUbc13 的表达受低温，甲基硫酸甲酯（MMS）和 H2O2 的诱导，但被甘露醇，脱落酸（ABA）和 NaCl 抑制。OsUbc13 可能位于质膜和核膜中。鉴定出约20 种蛋白质，这些蛋白质负责 OsUbc13 的阳性酵母双杂交相互作用。这些包括已确认的 OsVDAC（与细胞凋亡相关）， OsMADS1（对花器官的发育很重要），OsB22EL8（与活性氧（ROS）清除和 DNA 保护有关）和 OsCROC-1（Lys63 多泛素化的形成和错误所必需的） -无 DNA 损伤耐受性）。分子表征为 OsUbc13 的功能研究提供了基础。

关键词：水稻；泛素缀合酶；实时定量聚合酶链式反应；酵母双杂交

1 介 绍

泛素（Ubquitin）（Ub）是一种高度保守的76 残基蛋白，可以与赖氨酸共价结合

（K）靶蛋白在真核生物中的单 Ub 或多 Ub 链残基（Jentsch，1992; Grisvard 等，2010）。蛋白质泛素化是必不可少的翻译后修饰系统，可在多种细胞事件中充当信号转导机制，包括核糖体的生物发生（ Finley 等， 1989 ）， DNA 修复

（Jentsch 等，1987； Hofmann 和

^Dagger; Corresponding author

^* Project supported by the National High-Tech Ramp;D Program (863) of China (No. 2006AA10Z159) and the National Natural Science Foun- dation of China (No. 30871502)

copy; Zhejiang University and Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014皮卡特（ Pickart ）， 1999 年； Pastushok 和Xiao ， 2004 ） ， 蛋白质内吞作用（ Galan 和Haguenauer-Tsapis ， 1997 ），细胞周期控制

（Wei 等，2004），核因子kappa;B（NF-kappa;B）依赖性信号转导（ Chen 等， 2004 ）。 ， 1996 ； Tokunaga 等， 2009 ） ， 以及其他细胞过程

（Finley 等，1987）。泛素化通过一系列三个酶系统完成，包括 Ub 激活酶（E1），Ub 缀合酶

（Ubc 或 E2）和 Ub 连接酶（E3）。此外，Ub 分子可以通过供体 C 末端 Gly76 与受体七个赖氨酸残基之一之间形成的异肽键相互连接（McKenna 等，2003）。 Ub 链（Chau 等，1989）。通过Gly76-Lys48 的常规 poly-Ub 是通过 26S 蛋白酶体进行蛋白水解的主要信号

（Hochstrasser，1996），而 Gly76-Lys63 poly-Ub 以非蛋白水解方式调节多种活动

（Pickart，2001）。到目前为止，Ubc13 是唯一已知的能够催化 Lys63 连接的多泛素化反应的 Ubc，此功能需要与 Ubc 变体相互作用（Uev，其与 E2 Ub 结合酶具有相似的序列和结构，但缺少活性半胱氨酸残留物）;因此，它不同于其他 Ubc蛋白，它可以催化常规的 Lys48 连接的多泛素化

反应（Hofmann 和 Pickart，1999； McKenna 等， 2001）。Ubc13 最初被鉴定为无弯曲的，因为它的功能丧失突变影响了果蝇胃中的神经突触连接

性（Muralidhar 和 Thomas，1993； Oh 等， 1994）。酵母 ubc13 无效突变体显示出对 DNA 破坏剂（例如紫外线（UV）或甲基甲烷硫酸盐

（MMS））的敏感性和很高的自发突变率

（Brusky 等，2000）。Ubc13-Uev（Mms2）复合物催化的 Lys63 连接的链对于无错误的 DNA 损伤耐受（DDT，也称为复制后修复（PRR））是必需的，通过多泛素化增殖细胞核抗原（PCNA）

（Broomfield 等等人，1998； 2001； Hofmann和 Pickart，1999； Hoege 等，2002）在酿酒酵母中。人的 Ubc13 蛋白（hUbc13）也已被克隆

（Yamaguchi 等，1996）。转录因子 NF-kappa;B 通过与 Ikappa;B 家族的抑制蛋白相互作用而被隔离在细胞质中，它控制着许多过程，包括免疫，炎症和凋亡。Ikappa;B 蛋白可以被 Ikappa;B 激酶（IKK）复合物快速磷酸化，然后降解（Weil and Israel，2004; Chen，2005）。hUbc13-Uev1A 复合物通过催化 Lys63 连接的多 Ub 链的合成来激活肿瘤坏死因子受体相关因子 6（TRAF6）介导的 IKK，从而完成 TRAF6 的多泛素化（Chen，2012）。小鼠 Ubc13能够在功能上补充发芽酵母 ubc13 无效突变

（Ashley 等，2002）。在小鼠的先天免疫细胞中， Ubc13 对于胸腺细胞 T 细胞受体（TCR）介导的

NF-kappa;B 活化和转化生长因子-beta;-活化的激酶 1

（TAK1）磷酸化似乎必不可少（Sato 等。 ， 2005； Yamamoto 等，2006b）。小鼠中 Ubc13 的缺失导致血细胞严重流失以及胸腺萎缩和

骨髓，表明 Ubc13 在调节造血功能中也起着关键作用（Wu 等，2009）。在斑马鱼和拟南芥中，都有两个 UBC13 基因， ubc13a 和 ubc13b 或AtUBC13A 和 AtUBC13B。所有这四种 Ubc13 蛋白都可以与人类或酵母 Mms2 进行物理相互作用， 并且能够在功能上与酵母 ubc13 null 突变体互补，从而实现自发诱变和对 DNA 破坏剂的敏感性

（Wen 等，2006； Li 等，2010）。这意味着斑马鱼和拟南芥中存在与 Lys63 连锁的多泛素化反应和无差错 DDT 途径。ShUbc13 也能够与 ShUev 发生物理相互作用，并且可能参与纤毛链球菌Sterkiella histriomuscorum 中的 DNA 损伤反应

（Grisvard 等，2010）。最近，已经对水稻中的Ubc13 基因进行了研究。OsUbc13 即使在生物或非生物胁迫下也显示出高水平的普遍表达，其表达可以补充酵母 ubc13 null 突变体的无错 PRR 缺陷。此外，OsUbc13 在物理上与 Mms2 和 Uev1A 相互作用，并在体外催化 K63 连接的多泛素化作用（Zang 等人，2012）。

水稻是单子叶植物的重要模型，也是最重要的粮食作物之一（Yang 等，2011）。但是，关于植物中 Ubc13 的信息很少。在本研究中，我们克隆并分析了 OsUbc13 的分子特征，并研究了其亚细胞定位和相互作用蛋白，为进一步研究其功能和分子机理提供了基础。

1. 材料和方法
   1. 植物材料和处理

水稻品种 Nipponbare 的成熟种子脱壳并在10％（0.1 g / ml）NaClO 中灭菌 15 分钟，使其发芽，并在 28°C 的半固态 1/2 MS 培养基中生长

（Murashige 和 Skoog，1962）。 C 在 16 小时光照/ 8 小时黑暗的光照下持续两个星期。将幼苗转移到吉田溶液中（吉田等人，1976）两周，最后转移到室外并在田间自然生长。处于不同发育阶段的植物成分（来自四周龄幼苗的根和叶；来自圆锥花序的茎，雄蕊，雌蕊，外 lem 和面食

在开花后 15 天）收集实时聚合酶链反应（PCR）。为了分析响应激素和非生物胁迫的表达，使

用了在暗室中在 28°C 的培养条件下来自粳稻系Nipponbare 的胚胎细胞培养系。对于低温处理， 将胚胎细胞培养物从正常生长条件直接转移到 4°C 的培养箱中。暗室中 28°C 的培养用作对照。对于甘露醇，H2O2，MMS，脱落酸（ABA）和 NaCl 处理， 将胚胎细胞培养物从半固体 N6 培养基转移到补充

了 300 mmol / L 甘露醇，20 mmol / L H2O2、 0.01％的液体 N6 培养基中。 MMS，100 micro;mol / L ABA 或 200 mmol / L NaCl。在没有补充成分的相同液态 N6 培养基中生长的胚胎细胞培养物用作对照。除 0 h 的对照外，所有培养物均于 28°C 以

200 r / min 的速度置于摇床上，并于 2、4、8、 12 和 24 h 取样。每种处理重复三遍。所有材料

均在液态镍中快速冷冻。然后加入-80°C 进行 RNA 提取。

• 1. OsUbc13 基因的鉴定与克隆

OsUbc13，对应于蛋白质斑点 5002，是在我们先前的研究中从诱导特定器官的培养基诱导的 体根和芽再生系统中鉴定出来的（数据未显示）。

使用 MEGA4 通过邻居加入方法（ Tamura 等， 2007）。从 NCBI 数据库中检索了所有氨基酸序列 （ 在 线 资 源 1 中 提 供 ） (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

2.4 实时 PCR 检测 OsUbc13 基因的表达

根据制造商的规程，使用 Trizol 试剂（美国 Invitrogen）从大米材料中分离总 RNA。使用莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）第一链合成系统和 1 micro;g 新鲜提取的 RNA（Promega）合成第一链cDNA。SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（TaKaRa）用于实时 PCR 分析， 引物 qUbc13-F （ 5-ATGG CCAACAGCAACCTCC-3 ）和 qUbc13-R （ 5-TTA TGCACCGCTGGCATACA-3），qActin -F（5-GACT CTGGTGATGGTGTCAGC-3 ）和 qActin-R （ 5-G GCTGGAAGAGGACCTCAGG-3）。PCR 程序

如前所述（Wang Y.等人，2012），以水稻肌动蛋白 I 基因为参考，测定了 OsUbc13 在不同组织或不同条件下的相对表达水平和相对表达水平。在此，∆∆CT =（CT（Ubc13，测试）-CT（肌动蛋白 I，测试））-（C

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