基因组编码生物扩展了生物学功能外文翻译资料

基因组编码生物扩展了生物学功能

原文作者：Marc J. Lajoie, ^[1],^[2]Alexis J. Rovner,^[3],[4]Daniel B. Goodman,¹,^[5]Hans-Rudolf Aerni,⁴,^[6]Adrian D. Haimovich,^3,4Gleb Kuznetsov,¹Jaron A. Mercer,^[7]Harris H. Wang,^[8]Peter A. Carr,^[9]Joshua A. Mosberg,^1,2 Nadin Rohland,¹Peter G. Schultz,^[10]Joseph M. Jacobson,^[11],[12]Jesse Rinehart,^4,6George M. Church,^1,[13]* Farren J. Isaacs^3,4*

摘要：本文叙述了基因组编码生物（GRO）的构建和表征。我们将大肠杆菌MG1655中所有已知的UAG终止密码子替换为同义的UAA密码子，这样可以删除RF1并重新分配UAG翻译功能。该GRO与非标准氨基酸结合的特性有所提高，从而增加了体内蛋白质的化学多样性。同时对T7噬菌体的抗性增强，表明新的基因序列可以使病毒抗性增强。

关键词：非天然氨基酸 遗传密码 大肠杆菌 蛋白质合成 进化 基因组 磷酸 重排方法 核糖体。

基因序列保留使生物能够通过水平基因转移共享有益的性状（1），并能够在非原生生物中准确表达异源基因（2）。但是，通用的基因序列使得病毒可以利用宿主翻译功能（3）并降低细胞的活力。此外，转基因生物（GMO）可以将功能性DNA释放到环境中（4）。病毒抗性（5）和生物安全性（6）是当今生物技术中尚未解决的主要问题，暂不存在创造基因分离或抗病毒生物的通用方法。此外，生物技术受到标准基因序列的20个氨基酸的限制，这些氨基酸使用所有64个可能的密码子，从而限制了通过非标准氨基酸（NSAA）（7、8）扩展蛋白质化学性质的可能。

改变基因序列可以解决这些问题，并揭示出新的原理，这些原理解释了遗传信息如何被保存，编码和交换（图S1）。我们建议将基因组重新编码的生物（GRO，其密码子已被重新分配以创建替代的基因序列）从自然生物和病毒中基因分离，因为水平转移的基因会被错误翻译，从而产生无功能的蛋白质。此外，GRO可以提供专用密码子，以提高含NSAA的蛋白质的纯度和产量，从而强效而持久地将超过20个氨基酸作为一部分整合进基因序列。

我们构建了一个已删除了所有UAG密码子GRO，删除了释放因子1（RF1；在UAG和UAA处终止翻译），因此不会在UAG密码子处的终止翻译。该GRO允许我们引入新的UAG密码子，以及正交翻译机制[即，氨酰基-tRNA合成酶（aaRS）和tRNA]（7、9），从而将有效地将NSAA整合到蛋白质中的特定位点上（图1）。也就是说，只要有适当的翻译机制，UAG就能从无义密码子（终止翻译）转变为有义密码子（并掺入特定氨基酸）。我们选择UAG作为全基因组密码子重分配的第一个靶标，因为UAG是大肠杆菌MG1655中最少的密码子（在321个已知基因中），先前的研究（7、10）证明了为UAG掺入氨基酸的可行性，并有大量文献已经开发了能够为UAG掺入NSAA的翻译机制（7）。

我们使用了一种体内基因组编辑方法（11），在探索新的基因型和克服基因组设计缺陷方面，它比从头进行基因组合成更有效。尽管单个致死突变可以阻止合成基因组的移植（12），但我们的方法能够利用遗传多样性和进化来克服任何潜在的有害突变，其花费远低于从头合成基因组的成本（补充文本B“时间和费用”）。在先前的工作中，我们使用了多重自动化基因组工程[MAGE（13）]来去除10株为一组一共32株大肠杆菌菌株（11）中的所有已知UAG密码子，并使用结合组装基因组工程[CAGE（11）]来整合到四个菌株中，每组密码子约有80个变化。在这项工作中，我们克服了技术障碍（补充文本），以完成GRO的组装并描述其因基因序列变更出现的生物学特性。

GRO [C321. Delta;A，以321 UAG→UAA转换和prfA的缺失命名（编码RF1，表1）]及其RF1 前体（C321）表现出正常的原营养和形态（图S2），与大肠杆菌MG1655相比，倍增时间增加了60％（表S1）。基因组测序[GenBank登录号CP006698]证实，所有321个已知UAG都从其基因组中移除了，并且在构建过程中获得了355个额外的突变（每个碱基对10-8个突变，每增加约7340倍；图S3和表S2至S4）。尽管维持大肠杆菌MG1655基因型不是这项工作的主要目标，但未来需要提高基因组稳定性时可以利用mutS功能的可逆转换（14）来减少脱靶诱变。 CAGE改善了C321谱系中几种菌株的适应性（图S3），这意味着降低适应性的脱靶突变。

与以前的UAG密码子重分配策略相比，C321. Delta;A表现出更高的性能（15、16），可以将UAG从终止密码子完全重分配为能够将NSAA整合到蛋白质中的有义密码子。之前的一种策略使用了释放因子2（RF2）的变体，它表现出增强的UAA终止（16）和弱的UAG终止（17）。第二种策略用自然终止于UAG的七个必需基因取代了UAA终止密码子（表S5），并通过在其余314个UAG处有效掺入氨基酸来降低核糖体毒性（15）。为了进行比较，我们使用MAGE创建了菌株C0.B * . Delta;A :: S [表达增强的RF2变体（16）]，C7. Delta;A :: S（UAG在7个必需基因中变为UAA）和C13. Delta;A :: S [UAG在7个必需基因和6个非必需基因中变为UAA（表S5）]（表1）。 C表示密码子更改的数量，而A和B分别表示prfA（RF1）和prfB（RF2）操纵。与以前的工作相反（15），我们在这些菌株中删除了RF1而未引入UAG抑制剂，这可能是因为大肠杆菌MG1655中近同源抑制作用增加了（18）。然而，这些菌株表现出强大的选择压力以获取UAG抑制子突变（见下文）。为了评估去除RF1和重新分配UAG的适应性效果，我们测量了每种菌株的倍增时间和最大细胞密度（表S1和图S4）。我们发现，C321是唯一对RF1去除和UAG重新分配无害的菌株（图2）。因为我们没有修改RF2来增强UAA终止（16），所以确认RF1仅对于UAG翻译终止是必不可少的，而对于UAA终止或其他必不可少的细胞功能则不是必需的。相比之下，去除RF1削弱了对C0.B * . Delta;A :: S的适应性，并且密码子的重新分配加剧了这种效应（图2和图S5），这可能是因为NSAA的掺入克服了弱的UAG终止活性（17） RF2变体（16）。 C7. Delta;A :: S和C13. Delta;A :: S也表现出严重的适应性受损，这可能是由于在UAG密码子无RF1介导的情况下翻译，有超过300个不必要的UAG密码子使翻译停滞了（15）；因此，对乙酰基苯丙氨酸（pAcF）的结合部分减轻了这种影响（图2）。但是，并非所有的NSAA都能提高部分编码菌株的适应性。磷酸丝氨酸（Sep）可能会导致蛋白质组规模的错误折叠，从而损害相似菌株的适应性（19）。总之，这些结果表明，只有完全去除所有UAG密码子，才能克服这些有害影响。因此，它可能是持续NSAA翻译和完全重新分配其他密码子的唯一可扩展策略。

我们测试了编码菌株将NSAA [pAcF，pazidophenylalanine（pAzF）或2-naphthalalanine（NapA）]有效掺入绿色荧光蛋白（GFP）变体的能力，该变体包含零个，一个或三个UAG密码子（图3和图S6）。在存在NSAA的情况下，RF1 菌株可有效读取包含三个UAG的变体，表明游离的pEVOL翻译系统（其表达在UAG密码子处掺入NSAA的aaRS和tRNA）（9）具有极强的活性，且与RF1的竞争能力强。在没有NSAA的情况下，RF1-菌株表现出单个UAG的可检测量的近同源抑制（18）。仅当存在正确的NSAA时，C321. Delta;A :: S才显示出包含UAG的GFP变体的强表达，而C7. Delta;A :: S和C13. Delta;A :: S甚至在CNS. Delta;A :: S中也显示了所有三个UAG密码子的通读。缺乏NSAAs表明天然氨基酸可有效地掺入天然UAG中（17）。质谱表明，C13.DA :: S以UAG密码子掺入了Gln，Lys和Tyr。 C7.DA :: S和C13.DA :: S中的DNA测序揭示了glnV中的UAG抑制子突变，通过Western印迹（图3A）和质谱（表S13）提供了Gln抑制的直接遗传证据。 C0.B * .DA :: S显示了在没有RF1的情况下与UAG终止对应的截短的GFP变体（17）（图3A）。

我们使用质谱法（表S6至S12）直接研究了pAcF和Sep掺入对我们的一组菌株（表1）的蛋白质组（图3B）（20）的影响。没有观察到EcNR2含有Sep的肽，说明RF1的去除对于游离型丝氨酸系统（21）的NSAA掺入是必需的，该系统是效率低下的正交翻译机制（19）（图3C和表S10）。相比之下，我们观察到未编码的（C0.B * .DA :: S）和部分编码的（C13.DA :: S）菌株，而不是缺少的GRO（C321.DA :: S）菌株中，包含NSAA的肽。其基因组中的UAG（图3，B和C，图S7，以及表S6至S12）。 NSAA（或天然氨基酸）的这种不期望的掺入可能是针对C0.B * . Delta;A :: S，C7. Delta;A :: S和C13.Delta;A :: S观察到的适应性损害的基础。与其他RF1-菌株相比，C321. Delta;A :: S与其RF1 前体具有同等的适应性（图2），并且有效表达了所有GFP变体，而未在非预期位点掺入了NSAA（图2和3以及图S6）。因此，完全去除UAG是唯一为即插即用型NSAA掺入提供专用密码子而不损害适应性的策略（图2和3）。

为了确定这种GRO是否可以阻止病毒感染，我们用噬菌体T4和T7攻击了RF1-菌株。病毒依靠其宿主表达繁殖所必需的蛋白质。由于具有经过改造的基因序列的宿主会错误翻译病毒蛋白（3），因此重新编码可能提供了抵抗所有天然病毒的一般机制。鉴于UAG密码子很少出现并且仅在基因的末端出现，因此我们并不认为UAG重新分配会导致广泛的噬菌体抗性。虽然RF1的缺失对T4没有影响（277个终止密码子中有19个是UAG），但它显著增强了对T7的抗性（60个终止密码子中有6个是UAG）（图4）。

RF1-宿主产生的T7斑块明显较小，且与宿主倍增时间无关（图4A和图S8）。唯一例外的是C0.B * . Delta;A :: S，无论是否存在RF1，其产生的统计学斑块大小均相同（图4A和表S14）。与修改后的RF2变体可以削弱UAG的观察一致[（17）和本文]，我们的结果表明C0.B * .Delta;A :: S足以很好地终止UAG密码子以支持正常的T7感染。

鉴于噬菌斑面积和噬菌体适应性（每小时增加一倍）并不总是相关的，因此我们通过比较C321与C321. Delta;A的T7适应性和裂解时间，证实了RF1-宿主中的T7感染受到抑制（图4B）。噬菌体适应性（每小时加倍）可能是评估噬菌体抗性的最相关指标，因为它表明对数期噬菌体感染的扩散速度（22）。我们发现，在缺乏RF1的菌株中T7适应性明显受损（P = 0.002），动力学裂解曲线（图S9）证实了在没有RF1的情况下裂解明显延迟（P lt;0.0001，图4B）。同时，一步增长曲线（图S10）表明，RF1-宿主中的爆发大小（每个裂解细胞产生的噬菌体平均数量）也减少了59％（plusmn;9％），噬菌体包装被延迟了30％（plusmn;2％）（表S15）。我们假设核糖体停滞在基

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