蛋氨酸和胱氨酸双剥夺诱导ROS /自噬抑制胶质瘤增殖外文翻译资料

蛋氨酸和胱氨酸双剥夺诱导ROS /自噬抑制胶质瘤增殖

原文作者 Huailei Liu Weiguang Zhang Kaikai Wang

单位Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University

摘要：研究表明，癌细胞的存活和增殖高度依赖于蛋氨酸和胱氨酸（Met-Cys）。 然而，其分子机制尚不完全清楚。 本研究在调查Met-Cys的剥夺对胶质瘤细胞增殖的影响。 结果表明，Met-Cys双重剥夺对提高活性氧簇（ROS）水平，降低谷胱甘肽（GSH）水平和抑制胶质瘤细胞增殖具有协同作用。 此外，两者的剥夺能触发在体外和体内神经胶质瘤细胞的自体吞噬。 重要的是，Met-Cys双重限制性饮食抑制胶质瘤的生长。这些结果证明了Met-Cys代谢对影响胶质瘤细胞增殖的新调节机制，提示靶向Met-Cys代谢可能是胶质瘤治疗的潜在方法。

关键词：蛋氨酸；胱氨酸； ROS /自噬；胶质瘤增殖

1. 引言

胶质瘤是成人中最常见的脑肿瘤，其预后非常不理想（Wen和Kesari，2008）。 因此，了解胶质瘤肿瘤发生的分子机制是寻找新的治疗胶质瘤方法的关键和动力^[1]。细胞内活性氧（ROS）水平的增加是一种双刃剑，不仅对胶质瘤细胞的致瘤性要负责，而且对胶质瘤细胞的致瘤性，具有不利和重要影响（Sato et al。，2014; Shi et al。，2014）。广泛的研究已经证实，ROS和自噬作用在胶质瘤细胞中是有强大的内部连接的^[2]（Fu等人，2010; Shen等人，2014）。 自噬，其通过提供氨基酸，核苷酸和ATP，从而降解蛋白质和细胞器以维持细胞存活和增殖，其可以通过不同应激条件下在神经胶质瘤细胞中的ROS积累而诱导（Kaza等人，2012）。 然而，过度的或者延长的自噬可导致神经胶质瘤细胞死亡（Kaza等人，2012; Levine and Yuan，2005）。由于胶质瘤细胞中ROS和自噬的失调，最近已经认识到有效控制ROS和自噬之间的神经胶质瘤治疗的平衡的方法^[3]。

为了保持无毒性ROS水平，癌细胞具有自我调节系统以控制ROS的上调水平。L-谷胱甘肽（GSH）是最重要的抗氧化分子之一，具有抵抗诱导ROS产生的各种压力的功能^[4]（Ishimoto等人，2011; Jayakumar等人，2014; You和Park，2013）。作为GSH合成的重要底物，半胱氨酸源自两个途径：胱氨酸通过Xct转运蛋白和蛋氨酸循环的代谢产生（Shiraki等人，2014; Vene等人，2011）。蛋氨酸，是一种必需氨基酸，是S-腺苷蛋氨酸（SAM）合成和起始蛋白质合成所需要的必须氨基酸^[5]（Ogier等，1993）。含有由二硫键连接的两个半胱氨酸的胱氨酸是L-谷胱甘肽（GSH）的重要前体之一，其对于细胞中的抗氧化剂是必需的（Fotakis和Timbrell，2006）。以前的数据表明，阻断酶相关的Xct转运蛋白或蛋氨酸循环可以显著抑制癌症细胞生长（Dai等，2014; Lo等，2008; Modis等，2014; Najim等，2009; Wang et al。 al。，2014）。此外，许多研究表明，许多癌症的存活和增殖高度依赖于蛋氨酸和胱氨酸（蛋氨酸半胱氨酸）（Cavuoto和芬内克2012; Lo等人，2008）。然而，Met-Cys的剥夺导致胶质瘤细胞增殖停滞的分子机制需要进一步澄清^[6]。由此，我们推测，两个半胱氨酸供应者的阻断不仅可以改善内部ROS或自噬水平，而且可以进一步对胶质瘤细胞的增殖具有抑制作用。

在这项研究中，我们在Met或者Cys剥夺培养基中培养神经胶质瘤细胞，发现Met或Cys剥夺应激显著抑制神经胶质瘤细胞中的增殖和升高的ROS水平。此外，Met-Cys双重剥夺对增加的ROS水平与增殖停滞具有协同效应^[7]。重要的是，两个Met-Cys剥夺触发神经胶质瘤细胞在体外和体内自噬。由于癌细胞代谢在神经胶质瘤的起源和发展中起关键作用，靶向Met-Cys代谢可能是神经胶质瘤潜在的治疗策略，并且在进一步研究中可增加多方面有效的肿瘤治疗。

2.材料和方法

2.1细胞培养

人的神经胶质瘤细胞株U87和U251由中国哈尔滨医科大学第一附属医院脑科学研究所提供。所有神经胶质瘤细胞在含有1％链霉素和青霉素（Beyotime，China）和10％胎牛血清（FBS，Invitrogen，USA）的配量比例的培养基中培养。将谷氨酰胺（目录号：25030-149,100X，Invitrogen，USA）和丙酮酸钠（目录号：11360-070,100X，Invitrogen，USA）加到DME细胞培养基中（目录号：11960-044， Invitrogen，USA）。将L-谷氨酰胺（200mM，100X），丙酮酸钠（100mM，100X），胱氨酸（目录号：C7602，Invitrogen，USA）加到DME细胞培养基中（Cat＃：21013-024，美国）。将L-谷氨酰胺，丙酮酸钠，蛋氨酸（Cat＃：M5308，Invitrogen，USA）加入到DMEM（Cat＃：21013-024，Invitrogen，USA）中制备胱氨酸剥夺培养基。将L-谷氨酰胺和丙酮酸钠加入到DMEM（目录号：21013-024，Invitrogen，USA）中制备蛋氨酸和胱氨酸双剥夺培养基。将所有细胞在5％CO₂中保持在37℃下。蛋氨酸和胱氨酸的最终剂量分别设定为30mg / L和63mg / L。

2.2MTT测定

将胶质瘤细胞接种在以2000个细胞的密度/孔，具有六个复制孔96孔的培养板上。通过在指定的完全培养基中，制作出蛋氨酸剥夺，胱氨酸剥夺或met-cys双剥夺培养基分别建立四组。96小时后，向每个孔中加入10ml MTT试剂（5mg / ml，Sigma，USA），然后再温育4小时。在这以后，除去培养基混合物，并用200ml二甲基亚砜（Sigma，USA）代替。最后，在490nm的波长的分光光度计上（Tecan，Switzerland）检测细胞活力。为了测试自噬和细胞双重剥夺对神经胶质瘤细胞的细胞活力的协同作用，是否存在氯喹（CQ，15mmol，Cat＃：C6628，Sigma，USA）和3-甲基腺嘌呤（ 3-MA，2mM，Cat＃：M9281，Sigma，USA），判断其是否是自噬抑制剂。

2.3测量ROS和GSH

将胶质瘤细胞以10 ⁶个细胞/孔的密度接种在6孔培养板中，并分别保持在完全培养基，蛋氨酸剥夺，胱氨酸剥夺或met-cys双剥夺培养基中。48小时后，胶质瘤细胞与10mmol DCFH-DA（Cat＃：35845，Sigma，USA）在37℃，黑暗环境下温育30分钟，然后用胰蛋白酶消化细胞，磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗三次。在用200目的过滤器过滤细胞后，如综上所述（Ishimoto等人，2011），通过分析软件在流式细胞术和定量分析，对10,000个细胞中的DCF荧光的计算平均强度。使用GSH试剂盒（目录号：S0053，Beyotime，China）测定总GSH水平，并将结果重复三次，根据说明书用试剂盒提供的标准溶液进行标准化计算。

2.4用透射电子显微镜（TEM）检测自噬体

用0.25％胰蛋白酶（Invitrogen，USA）处理胶质瘤细胞，并以3000rpm离心20分钟。从有神经胶质瘤的小鼠身上切除神经胶质瘤组织。用3％戊二醛固定切除的细胞和组织，并用含有1.5％铁氰化钾的PBS中的1％OsO 4（OsO 4）固定1.5小时。用PBS洗涤细胞和组织，后用不同剂量的丙醇溶液进行梯度脱水。最后，将细胞和组织包埋以进行切片。将先前所描述的切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色5分钟（Fu等人，2010）。在Hitachi H-7650电子显微镜（Hitachi，H-7650，Tokyo，Japan）上捕获图像。

2.5Western印迹分析

将胶质瘤组织和细胞用RIPA缓冲液裂解，从裂解缓冲液收集蛋白质样品（Ai等人，2013）。用BCA试剂根据说明书测量样品的浓度。将12％SDSPAGE凝胶和PVDF膜各自用于蛋白质分离和转移。然后将PVDF膜在含有0.1％Tween-20的在室温下缓冲2小时（TBS），用5％无脂干乳阻断，然后在4℃下用第一抗体温育过夜。使用以下第一抗体：来自美国Sigma的抗LC-3抗体（Cat＃：L8918,1：200）和来自Santa Cruz Biotechnology的抗肌动蛋白（Cat＃：sc-47778,1：1000）。与IRDye 8680（LI-COR，B70920-02）或IRDye 800（LI-COR，926-32210）第二抗体相缀合的多克隆山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG在室温下孵育1小时，然后将条带捕获在Odyssey红外成像系统（LI-COR）。使用Odyssey V3.0软件测量每个条带的强度。肌动蛋白被设定为内部对照。

2.6体内实验

将裸鼠用10％水合氯醛麻醉，然后使用1ml注射器将100mL PBS中的U87悬浮细胞（2〜106）稀释液注射到裸鼠的左皮下（Reis等人，2012 ）。然后将移植U87细胞后14天的小鼠随机分成两组（n = 6 /组）。一组给予标准饮食（目录号：TP0010，Trophic Animal Feed High-tech Co.，Ltd中国），另一组给予Met-Cys双脱饮食（目录号：TP0016，Trophic Animal Feed High-tech Co. ）3周。每7天测量小鼠的体重。在实验后第35天从小鼠切除胶质瘤组织，然后测量胶质瘤湿重。 所有实验伦理和动物研究由哈尔滨医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

3.统计分析

所有值描述为平均值plusmn;SEM，并用ANOVA或Prism 5软件的不成对Student t检验进行分析。p lt;0.05被认为具有统计学意义。所有的体外实验重复三次。

4.结论

4.1蛋氨酸或胱氨酸剥夺降低胶质瘤细胞的细胞增殖

我们首先从培养基中仅取出蛋氨酸或胱氨酸以证实其对胶质瘤细胞的作用。如图1所示。 图1A和B，U87和U251细胞在有或没有在指定的时间点的蛋氨酸的培养基中培养。其结果表明，蛋氨酸剥夺显著降低胶质瘤细胞生存力。与蛋氨酸对神经胶质瘤细胞活力的影响类似^[8]，胱氨酸剥夺也显着降低神经胶质瘤细胞的数量（图1C和D）。此外，该抑制率以时间依赖性的方式增加。因此，这些数据表明蛋氨酸或胱氨酸缺乏导致神经胶质瘤细胞中的增殖阻滞。

4.2蛋氨酸和胱氨酸双剥夺对升高的ROS水平和对胶质瘤细胞增殖具有协同效应。

Met–Cys是半胱氨酸的两个主要来源，半胱氨酸是GSH合成的主要底物，它可进一步拮抗癌细胞中的ROS水平^[9]（Shiraki等人，2014; Vene等人，2011）。然后我们分析了Met-Cys对胶质瘤细胞增殖和ROS水平的双剥夺作用。如图1所示。 图2A-C，对升高的ROS和降低的GSH水平具有协同效应。此外，与单独的蛋氨酸或胱氨酸剥夺相比，它们的双重剥夺强烈降低了胶质瘤细胞的增殖（图2D和E）。总之，这些数据表明，蛋氨酸和胱氨酸双剥夺协同地提高ROS水平和降低的神经胶质瘤细胞的增殖。

4.3蛋氨酸和胱氨酸双匮乏引发了神经胶质瘤细胞自噬

我们上述实验结果表明Met-Cys剥夺提高ROS水平。此外，ROS和自噬在癌细胞中具有强的内在连接^[10]（Bellot et al。，2013; Li et al。，2012; Ray et al。，2012）。因此，我们接下来将检测Met-Cys剥夺对胶质瘤细胞自噬的影响。如图1所示。如图3A和B所示，Met-Cys缺失可强烈引起自噬体的形成和增加LC3-II蛋白表达，而这两者都是自噬相关的指示物。更重要的是，CQ，一个自噬抑制剂，其可通过阻断溶酶体和自噬体，与3-MA，另一个自噬抑制剂，其可通过抑制型BI磷脂酰肌醇3-激酶抑制自噬体形成的融合抑制晚期自噬阶段（PI -3K）^[11]（Levine和Kroeme，2008; Seglen和Gordon，1982）。如图1所示。 3C-F，CQ和3-MA治疗显着增强了胶质瘤细胞增殖抑制对Met-Cys双重剥夺的敏感性。这一现象表明Met-Cys双重剥夺对早期和晚期的自噬具有影响^[12]。总的来说，这些结果表明自噬抑制有效地增加Met-Cys双剥夺对胶质瘤增殖的抑制作用。

4.4蛋氨酸和胱氨酸双限制饮食能够抑制神经胶质瘤生长和体内引发的细胞自噬。

最后，我们在裸鼠体内建立了皮下胶质瘤模型，用于验证对神经胶质瘤增殖和自噬具有协同作用的Met-Cys双缺失。如图1所示。如图4A-D所示，

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