microRNA-mRNA的分析揭示了microRNAs在宫颈癌中的作用外文翻译资料

microRNA-mRNA的分析揭示了microRNAs在宫颈癌中的作用

Profiling of microRNA-mRNA reveals roles of microRNAs in

cervical cancer

背景：宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。 本研究旨在探索microRNA（miRNA）和mRNAs以及宫颈基因调控网络的表达谱在子宫颈癌中寻找候选分子标志物和关键致癌基因。

方法：采用miRNA和mRNA表达微阵列分别检测正常和癌症宫颈组织中miRNAs和mRNA的表达。 TargetScan 5.0数据库（UK）用于预测miRNA的靶基因，分析其与mRNA差异表达的交叉，并与miRNA的交叉呈负相关。 使用生物信息学方法分析目标基因的功能和途径，建立miRNA基因网络。

结果：正常宫颈组织和宫颈肿瘤组织中有29个miRNA和2036个mRNA差异表达。其中13个miRNA和754个mRNA在宫颈肿瘤组织中表达上调，16个miRNA和1282个mRNA表达下调。 与交点中的miRNA呈负相关的327个靶基因涉及功能和信号通路。 靶基因的上调miRNA和靶基因的下调miRNA分别涉及415和163个功能及涉及37和17个重要途径（P lt;0.05，假阳性率（FDR）lt;0.05）。 我们构建了miRNAs基因网络，发现hsa-miR-15a，hsa-miR-106b和hsa-miR-20b是网络中的关键节点。

结论：鉴定了宫颈癌和相关miRNA基因网络中差异表达的miRNA和mRNA。 它们在宫颈肿瘤发生中起重要作用，并且涉及许多重要的生物学功能和信号转导途径。 这些发现为miRNA在子宫颈癌发病机制中的分子机制研究奠定了基础。

关键字：宫颈癌；miRNA；基因表达；微阵列

宫颈癌是女性最常见的肿瘤之一。 其发病率在女性生殖道肿瘤中居首位，死亡率在女性恶性肿瘤中排名第二。 在全球范围内，每年报告大约有50万例新生儿宫颈癌，每年约有23万女性死于宫颈癌。^[1]

MicroRNA（miRNA）是广泛存在于真核生物中的单链、非编码的长度为22nt 的RNA。尽管miRNA通常被发现与3非翻译区完全或不完全互补（UTR）其靶分子降解mRNA或抑制mRNA翻译，它们也可以结合到其靶基因的编码区和5UTRs内的区域。我们已经鉴定了许多生物过程如细胞生长，分化，增殖和凋亡中涉及到的一千多种miRNA，最初发现的在B细胞慢性淋巴细胞性白血病（CLL）中的多种人类肿瘤中有异常和缺失的miRNAs表达。人们普遍认为miRNA和基因之间的异常互调导致的不平衡可能导致肿瘤的发生发展。微阵列技术具有速度快，产量高，特异度高，灵敏度高等优点。因此，使用miRNA微阵列和DNA微阵列作为构建miRNA / mRNA相互作用网络的研究工具，可以提高我们对宫颈癌发病机理的认识。虽然miRNA微阵列和mRNA微阵列可以检测和比较miRNA和基因的表达谱，但目前只有少数研究同时使用miRNA和mRNA微阵列方法，特别是在宫颈癌领域。 Rao等^[5]利用miRNA微阵列检测了13例宫颈肿瘤及其相邻组织中的miRNA表达水平，发现了大量差异表达的miRNA存在于宫颈癌肿瘤组织中。 Hudelist等利用微阵列方法检测宫颈癌细胞与正常子宫颈上皮之间的差异表达基因，发现了大量致癌基因、肿瘤抑制基因、生长因子、趋化因子，整联蛋白和转化生长因子beta;（TGFbeta;）家庭成员。子宫颈癌的形成与癌基因的激活有关，抑制基因失活以及与细胞周期、细胞凋亡、粘附、免疫和信号转导相关的许多基因簇的改变.^[4,6]因此，对子宫颈癌miRNAs表达谱及其靶基因的改变进行综合和系统研究将为揭示子宫颈癌发生发展，诊断和治疗的分子机制提供重要依据。

我们研究了临床子宫颈标本，可以比动物模型和细胞更客观，准确地反映miRNAs和mRNAs在子宫颈癌中的表达谱特征。 我们利用miRNA和mRNA微阵列方法结合生物信息学来预测miRNA与其靶基因之间的关系，分析miRNA调控机制，靶基因和信号转导途径的生物学功能，并在宫颈癌发病机制中建立了miRNA基因网络。

方法

临床标本

2008年1月至2010年4月，北京大学第三医院妇产科收入了8例病人，根据国际妇产科联合会的分类标准诊断为IB-IIB宫颈癌，8例患者在良性研究中纳入了子宫肌瘤等妇科疾病。实验组的子宫颈癌患者接受根治性子宫切除术和盆腔淋巴结清扫术;而将接受子宫切除术的良性妇科疾病患者纳入对照组。所有患者提供书面手术前知情同意书，宫颈肿瘤组织和正常宫颈组织根据微阵列采样要求在术中获得，并立即在液氮中冷冻，除了HE染色的部分，两名妇科病理学家检查确认诊断。收集术前宫颈分泌物，并使用混合捕获第二代技术检测人乳头状瘤病毒（HPV）感染。所有患者均未接受术前放射，化疗和免疫治疗。表1列出了所有患者的临床和病理资料。该研究获得北京大学伦理委员会批准（批准号：IRB00001052-06058）。

总RNA提取及mirna与基因表达谱芯片检测

总RNA的提取

使用Trizol试剂从两组组织样品中提取总RNA，并根据制造商提供的说明书，使用苯酚/氯仿萃取和沉淀/洗涤进行纯化。 将得到的RNA溶于无RNA酶的水中，储存于-80℃。

miRNA 微阵列

使用安捷伦的MicroRNA完全标记和Hyb Kit（p / n 5190-0456，USA）标记测量的（100ng）RNA，并直接用于微阵列（Agilent人miRNA寡核苷酸微阵列数据来自Sanger miRBase V12.0版本）。仔细清洗微阵列并使用微阵列扫描仪扫描（Agilent p / n G2565BA，USA）。 使用Agilent G4450AA特征提取软件10.0获得数据。

基因表达谱芯片

使用安捷伦全人类基因组芯片法（Agilent G4112F Design ID 014850,4times;44K格式）检测mRNA的表达。使用安捷伦低RNA输入荧光线性扩增试剂盒进行荧光标记，按照基因表达杂交试剂盒（Agilent p / n 5188-5242）的说明进行杂交，并使用微阵列扫描仪（Agilent p / n G2565BA）和安捷伦扫描控制软件A7.0版本进行扫描。 使用Agilent G4450AA特征提取软件10.0提取和标准化数据。

生物信息学分析差异表达miRNA和mRNA并构建miRNA基因网络

差异表达的miRNA和mRNA的筛选随机方差模型（RVM）t检验用于过滤宫颈肿瘤和对照组之间差异表达的miRNA和mRNAs，因为它可以有效增加小剂量样品的自由度。 计算错误发现率（FDR）以纠正P值。 P lt;0.05和FDR lt;0.05的miRNA和mRNA被认为是存在差异表达的。

差异表达miRNAs靶mRNA的预测和分析

使用TargetScan5.0数据库（UK）进行存在差异表达的miRNA靶基因的预测。 收集预测的靶基因和差异表达的mRNA的相交点。 基于miRNA和基因之间的负调控关系，获得了负相关的靶基因交叉，并用于分析其内在相关性。

基因本体(GO)分析

使用GO分析，NCBI的关键功能分类，分析目标负相关交叉基因的主要功能。 通常，使用Fisher精确检验和chi;sup2;检验对GO分类进行分类，并计算FDR以校正P值。 FDR越小，判断P值越小。 FDR被定义为FDR = 1-N k / T，其中Nk是指Fisher检验的P值小于chi;sup2;检验的P值的情况。选择只有P lt;0.05和FDR lt;0.05的GOs。

路径分析

类似地，使用路径分析来确定依据诸如京都百科全书和基因组之类的数据库与目标基因的交叉负相关的显著途径（日本KEGG），Biocarta（德国）和Reatome（美国）。再有，Fisher精确检验和chi;sup2;检验用于选择重要路径，P值和FDR定义了显著性阈值。 只要选择P lt;0.05和FDR lt;0.05的路径即可。

miRNA功能分析

根据显著的GOs与差异表达靶基因之间的关系以及miRNA与靶基因的关系,获得了差异表达的miRNA的主要功能。

miRNA-基因网络

基于miRNA与其靶基因之间的靶向调控关系构建了miRNA-基因网络。利用基于网络“度”的图论方法对网络中的miRNA和基因的状态进行评价。miRNA调控的靶基因数目被定义为miRNA的程度。越大,miRNA的程度越高。

使用实时RT-PCR验证差异表达的miRNA

使用实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）来验证作为miRNA基因网络关键节点的hsa-miR-15a，hsa-miR-106b和hsa-miR-20b的差异表达。从宫颈癌样品（n = 4）和对照样品（n = 4）中提取总RNA。使用Quant逆转录酶（TIANGEN，中国），dNTP和miR-RT引物和100ng总RNA合成cDNA。 对每个样品进行一式三份的PCR扩增。 每个实时RT-PCR反应（25微升）含有2SYBR Green Realtime PCR Master Mix，20mol / L引物和1mu;l模板cDNA。循环条件由95℃初始3分钟，然后在95℃下进行40个循环15秒，60℃20秒，70℃30秒。 两组比较采用t检验（P lt;0.05）。

结论

宫颈癌中差异表达的miRNA和mRNAs

筛选差异表达的mRNA有助于我们识别子宫颈癌中的分子标记和关键候选基因。 miRNA可以抑制miRNA的翻译或直接降解miRNA，作为参与基因表达的调节因子之一，促进子宫颈癌的发展。本研究利用miRNA微阵列检测宫颈癌组织4例和正常宫颈组织4例miRNA和mRNA表达，检测8例宫颈癌（包括4例）和8例正常子宫颈癌mRNA表达水平组织（包括上述4例）。我们发现有29个差异表达的miRNA（13个上调和16个下调）和2036个差异表达的mRNA（754个上调和1282个下调，P lt;0.05，FDR lt;0.05）。图1显示了结果的散点图，图2显示了聚类图。图1表示宫颈组织中的表达特异性和微阵列数据的可靠性。图2可视地显示miRNA和具有相似表达模式的mRNA，并有助于miRNA和mRNAs功能的进一步研究。这些结果表明，宫颈癌中存在大量差异表达的miRNA和mRNA，共同促进了宫颈癌的发生和发展。

图1.宫颈癌组差异表达的miRNA和mRNA的散点图。 A和B分别显示在宫颈癌组织中显着表达miRNA和mRNA。 横轴表示宫颈癌组织和正常组织之间的miRNA和mRNA的倍数变化。 纵轴表示样本之间的差异的t检验的P值。

图2.宫颈癌组织中显着表达的人类miRNA和mRNA的聚类分析。 图2A和2B分别显示在宫颈癌组织中显着表达的29个miRNA和2036个mRNA。 红色图标表示在宫颈癌组织中miRNA和mRNA的表达增加，绿色图标表示表达降低。 每行代表单个miRNA或mRNA，每列显示一个样品。

图3.与交叉口中miRNAs负相关的目标基因数量。 左侧圆圈表示2036个差异表达基因，右侧表示宫颈癌组织中29个差异表达miRNA的5117个预测目标基因。 两个圆圈的交点表示485个差异基因和327个目标基因与交叉口中的miRNA负相关。

差异表达的miRNA及其靶基因的预测

由于miRNA和基因之间存在许多相关性，因此用于准确识别其关系的方法是复杂的。目前仅使用生物信息学方法鉴定出少量的靶基因。在本研究中，使用TargetScan 5.0数据库鉴定了297个差异表达miRNA的5117个预测目标基因。 5117基因和2036差异表达mRNA的交叉点排除了不受差异表达miRNA调控的基因之后有485个基因。最后应用miRNA与其靶基因之间的负相关原理进一步获得327个靶基因，如图3所示。这些结果表明使用预测的靶基因和检测到的差异mRNA和负相关分析可以降低靶基因预测中的假阳性率，提高候选基因预测子宫颈癌的准确性。

GO分析 - 差异miRNA调控靶基因的功能分析

为了研究差异表达miRNA调控的靶基因的功能，我们对交叉点的327个负相关基因进行了GO分析，发现上调的miRNA参与了415个基因功能，下调的miRNA涉及163个基因功能（P lt;0.05，FDR lt;0.05）。显著上调的功能是细胞增殖，细胞周期，DNA依赖性转录调节，有丝分裂，T细胞共刺激，白细胞迁移，凋亡和炎症反应; 细胞增殖和细胞周期变化更为突出，表明异常细胞周期调控是宫颈癌的主要因素。总之，这些结果表明差异miRNA靶向基因参与了大量的生物学功能，促进了子宫颈癌的发生发展。

差异miRNA靶基因

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