海藻糖聚合物作为蛋白质稳定剂的辅料外文翻译资料

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海藻糖聚合物作为蛋白质稳定剂的辅料

摘要：本文介绍了四种不同的海藻糖接枝聚糖的合成方法，并对其稳定蛋白质的能力进行了研究。二糖,alpha;,alpha;-trehalose styrenyl缩醛改性,丙烯酸甲酯乙缩醛,styrenyl醚、丙烯酸甲酯一半导致四个不同的单体。然后，以偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，通过自由基聚合的方法对这些单体进行了单独聚合，合成了糖共聚物。辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶在孵化70和50°C,分别,beta;-galactosidase冻干多次在各种比例的聚合物或海藻糖。随后对蛋白质活性进行了测试，结果发现，与没有添加物和等量海藻糖相比，当聚合物在压力下存在时，蛋白质活性显著升高。对不同分子量(10kda、20kda、40kda)进行了测定，其稳定性均相当。然而，在不同的聚合物样品中，由于应力的不同，稳定性也存在一些细微的差异。苯醚海藻糖等小分子并不是比海藻糖更好的稳定剂，海藻糖单体降低了蛋白质活性，说明光化海藻糖还不够，需要聚合物结构。此外，我们还对NIH 3T3小鼠胚胎成纤维细胞、264.7小鼠巨噬细胞、人真皮成纤维细胞(HDFs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)进行了细胞毒性研究，聚合物浓度高达8 mg/mL。数据显示，所有四种聚合物对所有测试浓度都是无毒的。结果表明海藻糖共聚物是一种很有前途的添加剂，可以保护蛋白质免受各种胁迫。

介绍：

蛋白质被广泛用于实验室的试剂和许多不同疾病的治疗。然而，蛋白质的不稳定性增加了储存和运输的成本，降低了蛋白质药物的有效性。例如，温度波动、干燥和光会显著降低蛋白质的生物活性。蛋白质在生产和加工过程中承受额外的应激。例如，冻干法，又称冷冻法，是形成蛋白质粉末的最常见的方法，供其长期储存和处理的方法。然而，在冻干过程中，蛋白质暴露在极端的温度和浓度变化、低压、pH变化和干燥应力下，这些都会导致蛋白质变性或聚集。而且，即使以粉末的形式储存，随着时间的推移，蛋白质也会变性，需要添加辅料来维持活性。

许多辅料(添加剂)已被用来提高蛋白质的稳定性。最常见的辅料包括氨基酸、渗透物、糖、蛋白质、多聚物和盐，这些辅料用于防止药物蛋白变性。氨基酸，如组氨酸、精氨酸和甘氨酸，通过优先水化、直接结合和缓冲能力来稳定蛋白质。渗透压聚合物由于其突出的水化机制而被称为蛋白质稳定剂。糖，如蔗糖、乳糖和海藻糖，在冻干和液体形成中都被用来稳定蛋白质。人血清白蛋白和明胶广泛应用于蛋白质药物中。此外，聚合物还被用作添加剂，以防止蛋白质的聚集和变性。例如，添加到胰岛素中的聚乙二醇或聚丙烯乙二醇可以阻止蛋白质的聚集。两性离子聚合物偶联物也能显著稳定蛋白质，非离子型两性醇对膜蛋白在水中的溶解和变性有明显的保护作用。然而，尽管添加了辅料，许多蛋白质仍然表现出不稳定性。因此，开发新型的、无毒的蛋白质稳定添加剂是一个重要的研究领域。

在这篇报告中，我们描述了几种新的聚合物的合成和研究，这些聚合物可能用作辅料。聚合物有海藻糖单元。海藻糖是一种天然非还原性二糖，含有alpha;,alpha;-1 1-linked葡萄糖单元, 美国食品和药物管理局认为其是安全的。有趣的是，许多报告显示海藻糖在保护细胞和蛋白质方面起着关键作用，使生物体能够耐受无水(干燥)和低温(低温)环境。目前海藻糖广泛应用于食品和化妆品行业。

最近,我们报告的合成单体的4,6 (4-vinylbenzylidene)-alpha;alpha;-trehalose。所得到的聚合物具有吡啶二硫化物端基与游离半胱氨酸结合。当该聚合物与溶菌酶结合时，蛋白质的耐热性和冻干性显著提高。我们注意到，添加过量的聚合物(不与聚合物结合)也可以稳定蛋白质，这意味着该方法可能适合作为蛋白质辅料。本文介绍了四种海藻糖侧链聚合物的制备方法：将聚合物添加到三种不同的蛋白质中，并对蛋白质进行了加压，对处理后的蛋白质活性进行了评价，包括是否使用聚合物，以及海藻糖的用量。另外，用两只小鼠和两株人类细胞系测试了糖蛋白的细胞毒性。结果表明，该聚合物是一种有应用前景的蛋白质稳定添加剂。

实验部分：

材料：所有的化学物质和蛋白质均购自Sigma-Aldrich和Fisher Scientific公司，除非注明外都未经提纯使用。海藻糖是从健康管理公司(休斯顿，TX)购买的，在合成前用乙醇干燥并保存在真空中。稳定性研究中使用的海藻糖用乙醇干燥，冻干，在使用前保存在封闭的小瓶中。偶氮二异丁腈(AIBN)从丙酮中再结晶后，使用从Invitrogen公司购买的Amplex红糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒(Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay kit)，按照制造商的说明使用。(4、6)- 4-Vinylbenzylidene -alpha;,alpha;-trehalose (M1)根据文献的方法合成。

分析技术：在Bruker AV 500和DRX 500 MHz分光计上获得了核磁共振谱。获得了小分子弛豫延迟为2s，聚合物弛豫延迟为30s的1h核磁共振波谱。使用配备ATR附件的PerkinElmer FT-IR记录红外吸收光谱。凝胶渗透色谱法(GPC)是在岛津制作所进行的高效液相色谱(HPLC)系统和示差折光检测器RID-10A,一个聚合物实验室Plgel系列和两个聚合物实验室PLgel 5mu;m混合排列。洗脱液与LiBr DMF(0.1米)在40°C(流量:0.60毫升/分钟)。校准采用聚合物实验室近单分散pMMA标准。高效液相色谱纯化的单体进行高效液相色谱系统上用示差折光检测器RID-10A和一个5mu;m C18(2)与甲醇作为洗脱液。在一个水质试验平台上采集了ESI-MS数据。圆二色性(CD)光谱记录在Jasco J-715分光偏振计(Jasco，东京，日本)。对PerkinElmer金刚石差示扫描量热仪(DSC)进行了研究。大约2毫克样品1minus;3 mol %海藻糖在水中或准备在密封的铝锅。报告的值是由第二次扫描确定的。采用铂锅对PerkinElmer金刚石TG/DTA进行热重分析。200毫升/分钟下测量进行基于“增大化”技术流的温度范围30 - 600°C，升温速率为10°C /分钟。

方法：

具有代表性的自由基聚合。M1(426毫克,9.33times;10^minus;1)溶解在二甲基甲酰胺(DMF, 1.17毫升)。添加AIBN(7.00毫克,4.26times;10minus;2更易)。冻结五个周期后进行解冻,反应是由浸在油浴在80°C，用液氮冷却17 h后停止聚合，¹H核磁共振波谱法可知单体实现100%转化。本品经H₂O透析纯化3天(分子量 (MWCO) 3500 g/mol)，用冻干机干燥，得到P1。聚合物的数均分子量(M n)为19500 g/mol，多分散度指数(PDI)为2.01。¹ H NMR(D 6 500 MHz DMSO)delta;:7.11,6.39,5.45,5.23,4.96,4.86,4.41,4.12,3.97,3.78,3.70,3.62,3.48,3.17,1.60,1.24,0.86。

红外:nu;= 3384,2916,1635,1380,1150,1074,983 cm^-1。

辣根过氧化物酶加热研究。辣根过氧化物酶(合150mu;g /毫升)的实验方案是：在pH为7.0添加10毫米钠磷酸盐缓冲剂。制备了P1、P2、P3和P4的80、50、25和1个重量当量(wt equiv)的原液到HRP。加入海藻糖，使其与P1中海藻糖的量相等。样本为30分钟在70°C的环境,和一个非热控制样本存储在4°C到活动进行分析。3.3′,5.5′-Tetramethylbenzidine(三甲)作为底物和1 M H₂SO₄作为解决方案。为了评估活性，我们监测了450 nm处的吸光度。本实验共重复12次(n = 12，两个独立实验各6次)。

beta;-Galactosidase冻干法研究。beta;-Galactosidase(beta;-Gal, 0.4毫克/毫升)计划方案是添加beta;-Gal pH值7.0中和10 mM、磷酸盐缓冲剂。每个25mu;L整除beta;-Gal的方案是混合与75mu;L H₂O(控制)或75mu;L方案包含10，5，或1 wt的P1,P2,P3,P4,海藻糖相当于在P1为每wt的beta;-Gal H₂O导致蛋白质0.1毫克/毫升的方案。将各样品浸没于液氮中冷冻，然后用冻干法去除溶剂。样品在1 mbar下冻干12小时，循环一次。第一次循环后,添加100mu;L H₂O,冻干法重复下一个周期。样本存储在4°C的条件下，知道进行活性测定。后所需的周期数,最后冻干样品溶解到50mu;l H₂O中 . 添加三十毫升o-nitrophenyl-beta;- D半乳糖苷(ONPG 4毫克/毫升)添加到样本。样本5分钟在避光条件下孵化5分钟，反应停止后添加50mu;L 1 M Na₂CO₃。在405nm处的吸光度测定活性。实验共重复12次(n = 12, 2次独立实验，每次6次)。

聚合物分子量对蛋白质稳定性的影响。合成P1 (10,20,40kda分子量)。在HRP的稳定化过程中，每P1对HRP加入25 wt的equiv，对其稳定化效果进行研究。同时,对相同的聚合物进行了冻干性测试。每个P1加2.5 wt枚冻干三周期和化验结果如上所述。本实验共重复12次(n= 12，两个独立实验各6次)。

海藻糖衍生物和聚合物对蛋白质稳定化的影响。 用以下添加剂测试HRP和beta;-Gal对加热和冻干的稳定性的影响：P3，海藻糖（T），单体3（M3），苄基海藻糖（苄基T）和聚（苄基醚聚（乙二醇）甲基）（p（苄基PEG））。 将80个10 wt的每种小分子和聚合物分别加入到HRP和beta;-Gal中。 总共重复该测定12次（n = 12，两次独立实验，每次重复6次）。

P1minus;P4的细胞毒性试验。采用活/死活力/细胞毒性试验(Invitrogen)评价海藻糖共聚物与NIH 3T3小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3, ATCC)、RAW 264.7小鼠巨噬细胞(RAW 264.7, Cheng Genhong教授)、人真皮成纤维细胞(HDFs,Promocell GmbH)和人脐带静脉内皮细胞(HUVECs, Promocell GmbH)的细胞相容性。对照组仅含20 kDa PEG、海藻糖和缓冲液。NIH 3T3和RAW 264.7细胞在Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM;Gibco)上，添加 10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素minus;链霉素。HDF在纤维母细胞生长培养基上培养细胞(Promocell)，含2%胎牛血清(FCS), 1 毫克/ mL的碱性纤维母细胞生长因子(bFGF), 5mu;g /毫升胰岛素,和1%的青霉素minus;链霉素。HUVECs在含有2% FCS的内皮细胞生长培养基(Promocell)中培养，并使用供应商推荐的补充剂。将细胞以每孔5times;103个细胞的密度接种在48孔板（BD Falcon）中。 24小时后，用200mu;L含有已知聚合物浓度0.1,0.5,1,4和8mg / mL（P4至1mg / mL）的工作培养基替换培养基。温育48小时后，用预热的Dulbecco磷酸盐 - 盐水（D-PBS）轻轻洗涤细胞两次，并用LIVE / DEAD试剂（2mu;M钙黄绿素AM和4mu;M乙锭同型二聚体-1）染色。使用AxioCam MRm相机和FluoArc汞灯在Axiovert 200显微镜上捕获每个孔的荧光图像。计数活细胞和死细胞的数量，并通过将活细胞数除以细胞总数来计算细胞存活率百分比。所有实验均重复进行四次。通过使用公式100times;（活细胞数/细胞总数）计算结果。通过将每组标准化为对照而不添加任何添加剂来提供数据。

统计分析。所有p值均采用假设方差不相等的独立t检验进行计算。

结果：

海藻糖单体和糖聚合物的合成。 为了探索海藻糖糖聚合物的蛋白质稳定能力，我们设计并合成了四种不同的单体，M1至M4（方案1），并使用自由基聚合制备聚合物P1-P4。 连接的位置是通过海藻糖的4,6（M1和M2）或6（M3和M4）羟基，连接的化合物是缩醛（M1和M2），醚（M3）或酯（ M4），聚合物主链是聚苯乙烯（M1或M3）或聚甲基丙烯酸酯（M2或M4）。 我们预计这一组将使我们能够确定聚合物主链的影响或连接化合物对蛋白质稳定能力的影响。

(4、6)- 4-Vinylbenzylidene -alpha;,alpha;-trehalose (M1), 4, 6 - (3-propyl丙烯酸甲酯)-alpha;alpha;-trehalose (M2)使用styrenyl合成缩醛二乙酯和3,3′-diethoxypropyl meth-acrylate(2)为原料,分别在酸性条件下(方案1)。p-TsOH和海藻糖,M1和M2在41和37%的收益率。(另一个单体,6)- 4-vinylbenzylidene -alpha;,alpha;-trehalose(M3),准备在一个步骤中20%的收益率通过添加氢氧化钠和4-vinyl氯化苄海藻糖的一个解决方案。采用文献报道的方法，三步合成了乙酰化海藻糖和未加保护的一种醇。氯化乙酰化的海藻糖当时反应与methacryoyl在三乙胺的存在给M4′在64%的收益率。详细的实验步骤和所有单体的¹H和¹³C核磁共振谱见支持信息(SI)。

以AIBN为引发剂，采用自由基聚合法制备聚合物。苯乙烯基单体的聚合温度为80℃，甲基丙烯酸酯的聚合温度为65℃。制备得到的聚合物P1，P2，P3和P4（方案2），平均分子量（Mn）在14.6kDa和23.4kDa之间（对于实验细节和聚合物的氢谱，参见SI）。然后使用催化量将P4去保护，通过修改我们以前的报告上的方法来改变NaOMe;当脱保

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