钙离子对恢复受损厌氧氨氧化菌团的影响 ——副标题外文翻译资料

钙离子对恢复受损厌氧氨氧化菌团的影响

——副标题

Sitong Liu,Zuotao Zhang,Jinren Ni. 单位北京大学环境工程系水沙科学重点实验室

摘要：众所周知，细胞内游离的钙离子在解剖学上是重要的“第二信使”，并且被认为是细菌代谢的重要的调控者。我们调查研究了钙离子含量对修复厌氧氨氧化菌团的影响，其中近80%的细胞死亡或严重受损。化学药品和流式细胞术证明了钙离子含量是最重要的，并且在0.02-0.5mM范围内增加钙离子浓度供给时，恢复过程明显变快。利用流式细胞术和富拉红色荧光标记分游离钙离子的浓度有很强的的相关性，这个浓度被认为是支持厌氧氨氧化菌团恢复的内在原因。这项研究为离子对快速恢复受损的厌氧氨氧化菌团的影响提供了新的见解，尤其是利用厌氧氨氧化工艺在废水处理中高效脱氮。

关键词：氨氧化 ；受损 ；金属离子 ：钙离子 ：脱氮

厌氧氨氧是一种非常具有发展前景的生物脱氮工艺。氨氮可以利用亚硝酸盐和硝酸盐作为电子受体，在厌氧条件下，通过自养厌氧氨氧化菌氧化成氮气。氨氧化过程被广泛的研究，它在废水处理中具有重要的优势，如高氨氮去除率，运行费用低并且占地面积小。但是，功能性细菌是非常敏感的，并且容易被很多因素抑制，包括抑制物以及错误的操作环境。

因此，恢复厌氧氨氧化菌的抑制是保持厌氧氨氧化过程的长期运行的关键问题。我们提出了几种有效的方法。例如，控制进水基质浓度维持在较低的水平并且使用废水再循环，应用污泥驯化和加入调解物，以及将厌氧氨氧化菌嵌入凝胶载体，如嵌在厌氧氨氧化颗粒或生物膜系统中。尽管上述可逆抑制引起的酶失活可以迅速缓解，但其他一些严重的抑制可能使双方细菌损伤和死亡，这对厌氧氨氧化过程操作中最致命的，并且更多的策略必须考虑促进细菌体内的代谢，最终目标是恢复厌氧氨氧化菌的活性，促进氮的去除。

作为细菌代谢和生长必不可少的营养元素，金属离子在抑制厌氧氨氧化过程的恢复活动中发挥着重要的作用。钠离子和钾离子普遍含有细菌的功能，调节渗透压和参与细菌的代谢。亚铁离子和锰离子被报道作为转移的重要参与者。值得注意的是，最近离子对厌氧氨氧化性能的影响已经增加。硝酸的增加证明对促进亚硝酸盐氮的积累和厌氧氨氧化性能的增强是有用的。刘等发现了亚铁离子会通过厌氧氨氧化相关的过程来合并，与某些范围下亚铁离子的浓度有线性关系。增加的T-Mn的容量能够有效地增强厌氧氨氧化生物物质中的粗酶活性。最近的调查研究也确认了钙离子在废水中影响厌氧氨氧化菌造粒，并且额外的增加会造成氮的加载速率明显的增加。

在真核生物中，钙离子被认为是很重要的，因为它可以作为调节大多数细胞函数和生物过程的通用信号分子。细胞内游离钙离子浓度与信号转导密切相关，通常被视为“第二信使”在细胞和细胞活动的成功进行调整和增长。最近,越来越多的证据表明，在细菌中钙离子也具有重要的监管作用。Pitta等人发现细菌聚球藻属缺乏钙离子活动，而外部钙离子剂量可以恢复运动特征。Herbaud等人提供的证据表明,枯草芽孢杆菌中细小细胞中的钙离子由于EGTA的作用抑制了一些蛋白质的合成。结果还表明，一些基因在大肠杆菌的表达可能是通过钙离子。此外,越来越多的蛋白质含有各种钙离子，结合基序支持钙离子的重要性，控制各种蛋白质功能的影响蛋白质稳定性、酶活性和信号转导。通过这些重要的观察，它可以预测钙离子将对厌氧氨氧化代谢和受损的厌氧氨氧化菌造成影响，可能钙离子的浓度也更敏感。

这项工作的目的是为了证明钙离子对恢复受损的厌氧氨氧化菌团过程的影响。合适的钙离子剂量是根据增强细菌氧化恢复和厌氧氨氧化活性从而确定的。钙离子剂量显著增加的水平是由于稳态细胞内游离钙离子的增加，相应的提升恢复过程是通过增强细菌活动和增加活细菌百分比。演示了离子的影响和对潜在的应用前景进行了讨论。

2.方法

2.1.原始的细菌和细菌培养

在这个实验中，厌氧氨氧化联合应用一直在厌氧条件下培养1年，包含约60%厌氧氨氧化菌。合成废水喂养厌氧氨氧化菌团主要包括以氨氮和亚硝酸盐的形式存在于100 mg N/L亚硝酸钠和 100 mg N/L的 硫酸铵中。(1996)专门描述过矿质培养基的组成。合成废水的pH值，用盐酸和氢氧化钠调整为8.0plusmn;0.1。溶解液在培养容器内被控制低于0.5 mg /l，从而来实现厌氧条件。温度用自动加热器控制在35度。出乎意料的是,损坏的温度控制装置使温度发生了震动，导致高温在48 度内持续 1小时。之后,受损的菌团被倒掉和用在批次实验中。

2.2 批次实验

检查钙离子含量在厌氧氨氧化菌团恢复过程中的影响，五个浆液瓶被用于批次实验。原液中的钙离子浓度通过改变氯化钙的剂量，来调整到0.02mM,0.1mM,0.2mM,0.5mM和1mM即分别为样品A,B,C,D和E。所有的瓶子都在35摄氏度用厌氧培养法培养。氧气从用惰性气体冲洗10分钟的混合液中脱离出来并且浆液瓶用橡胶帽密封紧密,以避免任何外部氧气的影响。液体样本收集使用注射器与针头监测氮浓度。所有这些瓶子的上层清液每2天用新鲜的培养基液更换一次。整个实验持续7周。活着和死亡细菌的比例分别在培养2周和4周后用流式细胞术(FCM)来检测。细胞内游离钙离子在上周结束的时候进行了分析。详细的样品配置方案和采样时间已经列在表1。

2.3 化学分析

含氮化合物的浓度测量根据标准方法(APHA,1995)。干重的确定是干燥后的生物质在65度下于振荡器中至少至少24小时，然后污泥在700度的烧炉中烘干1小时，用干重减灰重量就是VSS。厌氧氨氧化活性是计算去每VSS氨氮的去除率。

2.4 FCM法分析生活和死亡的细菌

这些菌团首先会被滤膜过滤，尤其是FCM分析法专门设计的(Saitaike有限公司，北京)。滤液在冷却的磷酸盐(PBS)中收集、冲洗三次。之后,细菌悬浮液被膜联蛋白绑定缓冲稀释了(Kaiji生物技术有限公司、南京、中国)。51升膜联蛋白贴上Allophycocyanin(APC)和51升Propidium碘(PI)(Kaiji生物技术有限公司、南京、中国)被添加到每个100升细胞悬液。PI被用作死细胞的识别。孵化后在室温下15分钟，400会轻轻地膜联蛋白绑定缓冲和混合添加了。检测样品收集用FACS流式细胞分析仪，PI是在535 nm激光激发荧光和APC荧光激发在633纳米，并使用低流量。荧光阳性的比例是由使用峰会V4.0软件，来反映活着和死亡的细菌。

2.5 FCM法分析稳态细胞内游离钙离子

稳态细胞内游离钙离子是由使用FCM和Fura红色荧光标记技术。该菌团是首先过滤的过滤膜是根据FCM分析技术特别设计的。在PBS滤液截留冲洗了三次,然后在黑暗中37 度培养5 lM Fura红溶液(美国英杰公司有限公司) 30分钟。细菌与PBS溶液轻轻冲洗三次，用FCM的荧光进行了分析。Fura红色可以在荧光488纳米处与细胞内游离钙离子结合。分析荧光强度利用峰会V4.0软件。

3.结果与讨论

3.1.不同的钙离子剂量下受损的厌氧氨氧化菌团的恢复活动

我们比较了在不同钙离子剂量投加下的恢复活动行为。选择了五个不同的钙离子浓度来完成这个实验并将恢复配置文件的发展活动呈现在图1中，确认了厌氧氨氧化活动恢复率和钙离子剂量之间有很高的相关性。恢复时间大大缩短，厌氧氨氧化活动显然是随着在范围0.02 - -0.5mM内增加钙离子剂量的喂养方案而更频繁。当钙离子剂量在0.02mM(样品A),计算出的厌氧氨氧化活动从2.98mgNH^-4 - N /gVSS 每天，增加到13.86 mg NH^_4 - N /gVSS每天，7周后孵化。然而，厌氧氨氧化活动在钙离子剂量的0.1mM(样品B)可能会从1.99毫克NH^_4 - N /gVSS 每天，增加到15.82 mgNH^_4 - N /gVSS每天，6周之后孵化。因此，厌氧氨氧化活动的快速增加与加入的钙离子浓度是高度相关的。最明显的特性是钙离子的浓度在0.5mM,如图1所示(样本D)。对于该样品，最初的厌氧氨氧化活性很低，很难被测量。培养5周后,它突然增加到15.63 mg NH^_4 - N /gVSS。当增加的计量浓度在0.5mM以下时，菌团的恢复时间变短并且厌氧氨氧化活动更快。然而,钙离子剂量在1mM(样品E)时，会限制恢复并且过程变得明显放缓。这个结果暗示，进一步增加的钙离子浓度似乎会对菌团恢复产生负面影响。我们推测过多的钙离子可能会对细菌的能量代谢和基质代谢造成影响。

值得注意的是,厌氧氨氧化菌生长非常缓慢，并且长期不可避免地需要恢复受损的菌团。这一缺陷使受损的厌氧氨氧化菌团恢复策略的发展及为其工程应用变得十分紧急。最近,一些关于金属离子对细菌的影响活动的研究也开始进行(Pintathong et al .,2009;Violante et al .,2010)。离子如K 、Na 钙离子和Mg² 是活动中必不可少的金属离子和细菌代谢过程中关键酶的辅因子(Wackett et al .,2004)。这项研究首先理论上给予钙离子用量，在一定程度上对受损厌氧氨氧化菌团的恢复活动有好处。

图1厌氧氨氧化菌随时间和钙离子浓度变化的活性变化图

3.2 用FCM法分析在恢复过程中细菌的受损和死亡

钙离子用量对活着和死亡的细菌有很大的影响，这是细菌损伤至关重要的信息。在恢复过程中，我们发现PI-positive细菌(细菌死亡)的显著减少与原来受损的菌团有关，根据FCM分析，其中约80%的细菌会死亡或严重损坏。在确定培养过程中钙离子的影响时，不同的钙离子浓度下恢复受损的厌氧氨氧化菌团的过程中，细菌荧光检测到不同的变化。这个测量是首先进行了2周的孵化 (14天)。对所有样本观测，同时发现了相当比例的细胞细菌死亡,这是因为厌氧氨氧化菌的缓慢增长和缓慢刷新的菌团。然而,应对不同的钙离子剂量显然已经验证是可区分的。如图2所示，随着增加钙离子浓度，细菌恢复变得快速并且更快速减少细菌死亡。死亡细菌细胞的百分比当钙离子剂量在0.02mM(样本A)时，仍然是基于计算值超过60%。当钙离子用量增加到0.2mM(示例C)时，它下降到lt; 50% 。这一趋势类似于上述的钙离子剂量浓度对厌氧氨氧化恢复活性的影响的结果。

样品培养4周后(28天)，死亡细胞百分比显著下降到20%左右，表明受损的厌氧氨氧化菌团培养后有效恢复(图3)。相应地，所有样品的厌氧氨氧化活动在这个潜伏期内突然增加(从图1)，这里获得的数据也正好与上述获得的趋势一样，用增加钙离子的剂量来加快菌团恢复。钙离子剂量在0.5mM(样本D)时恢复最快，在完整细胞的比例提高到70%以上(最高)的情况下，死细胞的比例明显降低。这种现象特别吻合我们之前的结果，钙离子的用量在一定范围内可以帮助快速恢复受损的细菌。相比之下，进一步增加钙离子的浓度在1mM(样本E)培养时，会导致相对高的细菌死亡数百分比。

图2 在恢复过程中不同的Ca² 剂量对活着和死亡的细菌的百分比的比较 （样品经过2周的潜伏期）

3.3 FCM法检测稳态细胞内游离钙离子水平

为了解释钙离子剂量浓度在菌团恢复中重大影响的内在原因，我们测量了培养7周后(49天)稳态细胞内游离钙离子的变化。用Fura红色荧光法检验了细菌细胞内游离钙离子。因此该荧光反应增加的量就是细胞内游离钙离子增加的水平。我们确定了在不同的钙离子浓度剂量条件下，细胞内游离钙离子的荧光差异。结果如图4所示。根据荧光强度的评估，我们可以看到，整个数量的细菌钙离子剂量浓度增加，移动到更高的荧光强度中。平均荧光强度分别为9.45(a.u)，11.9(a.u)，16.8(a.u)和36.5(a.u)，分别对应样本的钙离子剂量在0.02mM(样本)，0.1mM(示例B)，0.2mM(示例C)和0.5mM(样本D)时。

图3在恢复过程中不同的Ca² 剂量对活着和死亡的细菌的百分比的比较(样本经过4周的潜伏期)

这一结果表明在培养时钙离子浓度的增加，会稳态响应细胞内游离钙离子水平显著提升。投加的钙离子浓度明显影响吸收钙离子的细菌。此外，我们发现细胞内游离钙离子的升高与在细菌菌团的厌氧氨氧化活动增加菌团的恢复之间呈线性关系(如图1和4所示)。然而，我们未能检测荧光会随着进一步在1mM(样本E)内增加钙离子剂量浓度而增加。

在这项研究中，我们的观点是增加不同的外部钙离子浓度可能会引起稳态细胞内游离钙离子的差异，并显著加速恢复受损的细菌。据报道，细胞中大部分蛋白质与钙离子是结合的(Bazzi和Nelsestuen，1991)。酶中的微生物有效活动是至关重要的。更重要的是，细胞内游离钙离子是一直被视为细菌重要的标志，并且通过细胞内代谢与结构和DNA恢复目标(荷兰等 .，1999;Naseem等人，2007)，发挥他们的各种控制代谢功能，。在稳态细胞内游离钙离子上升可以促进“第二信使”的丰富和细胞钙离子结合蛋白规范的水平。这些结果的一个可能的解释是，极其丰富的细胞内游离钙离子，即细胞内的“第二信使”，可以使相关酶变得更加活跃，从而做到高水平的细菌恢复。越来越多的细菌中的钙离子已确定，从而将以这些监管机构的独特位置来影响细胞的生长和生存。此外，我们的数据报告在此表明，细菌细胞的代谢在给定的条件下活动积极。因此，稳态与增加细胞内游离钙离子水平可能是有利于发

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