镉，银，汞和铅短期预暴露对厌氧氨氧化微生物的抑制和恢复
摘要：本实验通过批次实验的方式研究了Cd, Ag, Hg，Pb对于厌氧氨氧微生物的抑制作用。抑制与修复实验均在24h到72h内完成。IC50（脱氮速率抑制50%）浓度等级如下：Cd为11.16 plusmn; 0.42 mg/L，Ag为11.52 plusmn; 0.49 mg/L，Hg为60.35 plusmn; 2.47 mg/L。Pb浓度为40 mg/L时，厌氧氨氧化菌的脱氮速率仅减小7.19%。抑制作用的效果的顺序是：Cd gt; Ag gt; Hg gt;Pb。此外，高浓度金属暴露减小粗酶活性（肼脱氢酶）以及亚铁血红素c的浓度。在这四种金属中，Cd与Hg能够对厌氧氨氧微生物保持持续的毒性，但是，在96h内移除Ag与Pb两种重金属之后，厌氧氨氧化菌的活性能够得到很大程度上的恢复。
1 介绍
厌氧氨氧化过程作为一种新型高效的生物脱氮技术，可用于含高浓度氨氮废水。与传统的硝化—反硝化工艺相比较，自养过程减少100%有机的消耗和至少少于50%的耗氧量，具有较低的运作成本。最近，Tang et al.报告了一个实验室规模的厌氧氨氧UASB反应器，具有较高的氮去除率74.3-76.7 kg N/m3/d，这证实了厌氧氨氧在污水处理过程当中的具有较高的脱氮速率的潜能。尽管一些生产性规模的厌氧氨氧化过程已经成功运行，运行过程中存在很多抑制因素，诸如基底（氨氮和亚硝酸盐），有机物质，盐类以及重金属，这些原因阻碍了厌氧氨氧化过程对于含氮污水中的应用。
不像大多数的有机污染物，重金属是不可生物降解，而且能够在生物体中富集，造成污水处理过程中微生物活性的恶化。在天然，受污染以及人工生态系统当中，鉴于重金属的种类以及浓度，抑制作用可能会表现出更大的不同。微生物需要一些低浓度金属元素，诸如：Cu(II), Zn(II), Co(II), Fe(II), Mn(II)与Ni(II)是生物辅酶因子、金属蛋白酶以及某些酶的必须微量营养物质。当这些金属不充足时，特异性金属运载体能通过不同的运输系统被诱发诸如被ATP运输。然而，在较高浓度下，重金属对于大多数的微生物变得具有毒理性。微生物中发生许多不同的金属分配（摄取），包括胞外吸附，跨膜传递输送，以及细胞内富集。由于胞外聚合物，金属摄取的过程当中吸附作用发挥一种重要的作用。由于二氧膦基脂质，蛋白质以及多糖存在于细胞表面，细胞表面包含各种各样的结合位点，包括氨基，羧基的，磷酸盐机能的团体[12]。被动或活跃跨膜运输主要取决于金属浓度与微生物的活性[13,7]。人们通常认为金属离子通过膜孔蛋白在外层分散开，然后通过不同的途径运输通过细胞质膜。一旦其进入细胞，重金属就会与核酸以及酶活性位点相互作用，他们迅速降低膜功能完整性，这也普遍表现为细胞溶质的泄漏(如：K )以及细胞死亡[14,15]。
一些含氮废水，诸如垃圾填埋场渗滤液，医疗废水，通常包含高浓度的重金属离子，诸如镉，银，汞，铅，铬，铜，锌，这类离子对厌氧氨氧化进程存在着抑制作用[5,16]。比如，在一些落后的城市和干旱的地区，人们发现垃圾场渗滤液里的重金属离子一般有毫克左右[17,18,19]。
然而，只有少许的研究针对于这些重金属对于厌氧氨氧微生物的影响。比如。van de Graafet al. [20]论证了1 mmol/L下的HgCl2能完全抑制厌氧氨氧化活性。Yang et al[21]则报导了，用线性回归方程计算，在厌氧氨氧混合培养基中Cu(II)的IC50的浓度被计算出12.9 mg/L。在5 mg/LCu(II)造成了厌氧氨氧化菌的细胞溶解，在短期内将厌氧氨氧化活性降低到了94%。在没有添加Cu(II)时，厌氧氨氧化菌的恢复过程与厌氧氨氧化启动过程相一致。然而，Lotti et al.[16]报导在厌氧氨氧化菌进行24h暴露，使用一个指数抑制模型计算出Cu(II)最大抑制半浓度为1.9 mg/L。迄今为止，重金属对于厌氧氨氧化过程的抑制一直是让人困惑并且不完整。当厌氧氨氧化过程呈现出必然性以及有用性，应该对重金属与厌氧氨氧化菌的相互作用有更好的理解通过，能帮助修正修补性的方法来防止重金属的毒理性。因此，这是很有必要的来获得一种洞察力对于重金属对于厌氧氨氧生物化的作用，并且深入的研究。
在这项研究中，重金属Cd, Ag, Hg, Pb对厌氧氨氧化过程存在个别抑制作用，由于这些金属通常在垃圾填埋场渗滤液中，并被认为对于大多数微生物生长的有潜在毒性。基于这些重金属预暴露对厌氧氨氧化菌的特性，本研究的目标如下：（1）在单一金属离子对厌氧氨氧化菌脱氮性能的抑制影响半数抑制浓度（IC50）的浓度。(2)研究预暴露对厌氧氨氧化菌的粗酶活（肼脱氢酶，HDH）活性和血红素C浓度的影响。（3）重金属抑制后，厌氧氨氧化菌的恢复性能。
2. 材料与方法
2.1.微生物和培养媒介
用于批处理实验的厌氧氨氧化污泥来自实验室的实验室规模升流式柱状厌氧氨氧化反应器。通过FISH分析，得出ksu-1株（ab057453.1）的厌氧氨氧化菌大约占种子污泥中总生物量的70–75%。实验中所使用的基质主要由表中氨氮和亚硝氮（由硫酸氨和亚硝酸钠提供）和碳酸氢钾作为唯一碳源。为了避免其他金属离子的干扰，微量矿物元素在这项研究中没有添加到培养基中。
2.2.批次试验过程
通过批次实验研究重金属对厌氧氨氧化脱氮性能的影响和IC50。每个试验分为24小时暴露阶段和随后的72小时恢复期。该试验在装有100毫升培养基的120毫升血清瓶中进行，厌氧氨氧化菌浓度（854毫克/升浓度MLVSS）。每种金属，进行三次重复实验。重金属测试的浓度范围为铬：0–10 mg/L；银：0–10 mg/L； 汞：0–30 mg/L；铅：0–40mg/L。
2.2.1.暴露试验
初始浓度为100 mg/L的NH4 -N（相当于7.14mM（NH4）2SO4）,120mg/L NO2--N（相当于8.57mM NaNO2），125mg/L的KHCO3和不同浓度的重金属。厌氧氨氧化菌取自反应器，使用洗涤液（pH值为7.0和0.1 M NaCl的等渗液）洗涤三次去除残留氮。通过2%的硝酸或1 N氢氧化钠滴加调节初始溶液pH值为7plusmn;0.2。。厌氧瓶充入氮气以除去溶解氧从而防止氧气抑制厌氧氨氧化微生物[22]。然后将厌氧瓶放入到35plusmn;1°C和170rpm恒温振动箱中。每三小时使用注射器针头获得样品，随后分析从而确定重金属对厌氧氨氧化菌的脱氮性能的影响和采用孔径为0.45过滤，测定金属离子浓度。在每次试验结束时，微生物样品被保留用于测量VSS（挥发性悬浮固体），粗酶（HDH）活性，血红素C的浓度和细胞内的金属浓度。
2.2.2.恢复试验
在暴露试验后，将各个瓶的微生物用含有EDTA的溶液洗涤[12,23,24]。把1600克厌氧氨氧化生物量混合物离心5分钟。离心后保留的沉淀物，重新悬浮于30毫升的洗涤液（1mMEDTA，pH值7.0，和0.1M NaCl的等渗液），并以150rpm搅拌30分钟来除去表面结合的金属，接着进一步将混合物在1600g下，离心5分钟，离心两次。每次离心，除去上清液并再悬浮于洗涤溶液里10分钟。然后，每24小时更换一次不含重金属的基质溶液，每次更新培养基时，进行步骤和操作与预暴露实验条件相同。在恢复测试中，每24小时取得样品。在每组试验中微生物样品也同样保留，用于检测VSS，粗酶（HDH）的活性，血红素C的浓度和细胞内的金属浓度。
2.3.分析方法
在使用孔径为0.22滤膜过滤后，用离子交换色谱（ICS-1100，DIONEX，AR，USA）检测硝酸盐和亚硝酸盐。NH4 -N与VSS的浓度是根据标准[25]来测定的。pH的测定方法是使用数字式酸碱计(PHS-25, Leici Company, China),DO则是使用数字DO计来测量(YSI, Model 55,USA).
2.4.细胞内的金属离子浓度的测定
在开始以及各试验结束时，取各瓶中0.1克（湿重）用来测量细胞内金属浓度，然后用EDTA洗涤程序清洗[12,23,24]。在25分钟内以1rpm的速度转速使固体颗粒被硝酸溶液溶解（33％V/V）。随后，使混合物在22000g离心力下离心15分钟，得到上清液。在上清液中的可溶性重金属浓度可以通过原子吸收分光光度计测定。
2.5微生物粗酶的提取和预处理
在每次测定结束时，取样品，用磷酸钠缓冲溶液，在22000g离心力和4°心下离心20分钟清洗两次(20 mM, pH 7.0)。然后让洗涤颗粒悬浮在20毫升的相同缓冲液中通过冻融裂解以及超声处理的溶解。(225 W, at 4°C for 30 min, Ultrasonic processor CPX 750, USA)。细胞混合物在22000g离心力和4°C下离心30分钟。将上清液贮存于-20°C中,并且用作测定蛋白质浓度和粗酶（LDH）活性的细胞提取物。蛋白质浓度则根据布拉德福德程序测定[26]。使用BSA作为标准。（HDH）肼脱氢酶的测定是根据由岛村等人描述的方法[27]。使用分光光度计测定混合物550nm处的细胞色素c的吸光度（V-560 UV / VIS分光光度计，日本分光，日本）。根据在文献中描述的方法该粗酶（HDH）活性表示为molcytochrome C reduced/min/mg protein。血红素c含量根据在文献中描述的方法来测定。 [28]。
2.6.评估IC50：
根据下面公式计算NRR
(1)
其中，CTN(inf)和CTN(eff)是进水和出水（毫克/升）的总氮浓度
;Vmidium为0.1L。IC50值，线性回归方程和指数模型评估每组实验中NRR抑制50%的重金属浓度。
2.6.1.线性回归模型
根据线性回归方程，从下面的方程式中获得抑制百分比（IP）：
(2)
其中，CTN（inf）和CTN（eff）是进水和出水（mg/L）的总氮浓度
其中，Ycontrol和Y1是不含和含有重金属试验组的NRR（mg/g VSS/h）。针对IP（％）与重金属浓度关系曲线可以用批次实验来获得。在IP（％）= 50时，获得IC50。
2.6.2.指数回归模型
改进的非竞争性抑制模型（等式（3））被用来评估重金属对厌氧氨氧化微生物的抑制特性。IP (%)可从下面的等式所得：
IP(%)=(3)
其中a是添加到系统中的重金属浓度（以毫克/升），b是IC50的值（以mg / L），而n是嵌合参数。式。（4）可通过改变公式（3）的形式获得：
(4)
其中A = [100 IP(%)]/100。Line对称r曲线（1/ A 1）可以使用批量测试数据来获得。
3.结果
抑制率和重金属浓度之间的关系可以通过线性回归和指数回归方程来描述，如表1.对于每种金属，通过线性方程和指数方程拟合得到较高的R2为最合适的方程。对于铅对厌氧氨氧化过程的抑制，线性模型和指模模型都不适用，主要原因是生成碳酸盐沉淀和碳酸氢盐。
3.1.Cd影响
整个试验过程中，镉被证明是所有被测试的金属中最具毒理性的金属。在曝露试验时，镉在低范围0-2 mg/L，对厌氧氨氧化过程没有明显的抑制作用，NRR稳定在8.72-9.28mgN/gVSS/ h的水平，如图1（a）。然而，镉浓度增加，抑制作用增强。例如，6 mg/L时，NRR降低到7.53mgN/gVSS/h，浓度超过8毫克/升时抑制作用变得更为明显。根据指数回归方程，镉对厌氧氨氧化过程抑制的IC50为11.16抑制的程抑mg/L，NRR为4.64mgN/gVSS/h，而对照组的NRR为9.28mgN/gVSS/ h。
实验结果证明，Cd对厌氧氨氧化微生物的影响可以维持在72小时的恢复试验，且浓度增加时毒性增强。如图所示。图1（b）。在剂量超过1mg/L，在24-96 h时，NRR明显降低。在Cd浓度为10mg/L中暴露24h，NRR从4.38下降到1.14mgN/ gVSS/h。
在培养基中总可溶性Cd浓度的最高剂量10mg/L和细胞内Cd浓度也用ICP测量。开始，镉的测量浓度为9.41为L量/ gVSS，主要以游离离子的形式存在，而细胞内的镉浓度未检出。在暴露试验（24h）时，培养基中可溶性Cd仅0.05mg/L，这主要是因为部分显著可溶性镉是被厌氧氨氧化微生物吸收。然而，厌氧氨氧化微生物中积累的镉的含量为29.36累的物中积mg/gVSS。图1（c）表明了在暴露试验（24h）结束和恢复试验的（24-96小时），测定粗酶活性和血红素Ccedil;。在开始时，粗酶活性为1
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