三电极反应器提高厌氧氨氧化 生物活性研究外文翻译资料

三电极反应器提高厌氧氨氧化

生物活性研究

原文作者 Xin Yin, Sen Qiao*, Jiti Zhou, Xie Quan

摘要：本论文的目的在于探讨在三电极反应器中不同电极电势（EPs）对厌氧氨氧化菌活性的影响。其中，当工作电极和参比电极两者的电极电势差为0.08V时，脱氮性能最好。当小于最佳电极电势差（EPD）0.08v时，反应器2（R2, 利用电极电势）氮的去除率在188天时达到911g-N/m3/d，比反应器1（R1）高25.3%。而且，根据扫描电镜结果和对胞外聚合物的分析，表明利用电极电势有利于电极表面的厌氧氨氧化菌生长。此外，研究表明生物电极厌氧氨氧化反应器中，长期利用电极电势，有效增强原始酶的活性和增加细菌的数量。另外，根据透射电镜扫描结果显示了厌氧氨氧化菌在连续运用电极电势下的形态变化。

关键词：厌氧氨氧化；三电极反应器；电极电势；胞外聚合物；关键酶活性

1 引言

厌氧氨氧化菌把亚硝酸盐作为电子受体，催化氧化氨，最终生成氮气，作为主要产物(Mulder et al.,1995)。由于是化能自养的过程，对曝气没有要求，相比较于传统的硝化-反硝化系统，厌氧氨氧化工艺具有低成本和低能耗等优势(Op den Camp et al., 2006)。因此，厌氧氨氧化工艺被认为是一个可持续的生物脱氮技术。尽管全世界生物反应器超过100台正在运行，厌氧氨氧化工艺广泛使用的挑战仍然存在很大的困难(Lackner., 2014)。厌氧氨氧化运用的一个最大阻碍是厌氧氨氧化菌生长速度缓慢，导致启动时间较长(Strous et al., 1998)。

在过去的几年里，一般选择合适的反应器类型，尝试各种不同接种污泥和使用不同类型的载体，旨在缩短启动时间(Chen et al., 2012)。除了以上方法之外，还有一种潜在的替代方法是通过增强厌氧氨氧化菌活性，促进厌氧氨氧化菌的代谢，避免了启动时间长的这一不利因素。这个方法，可以加速厌氧氨氧化菌的生长。近来，许多研究已经采用有效的方法增强厌氧氨氧化菌的活性，如电场强度，金属离子和石墨烯氧化物。例如，Liu et al.(2008)和Duan et al.(2011)采用外加磁场60mT和超声强度为0.3w/cm²方法成功地增强了厌氧氨氧化菌活性和最大氮去除率分别提高了30%和25.5%。据预测，磁场和强度超声能够影响细胞膜渗透率，强化底物的吸收。Qiao et al.(2012)采用添加二价铁，改善关键酶和细菌的活性，从而实现厌氧氨氧化快速启动过程。Wang et al. (2013)年也表明石墨烯氧化物能增强厌氧氨氧化菌活性，促进胞外聚合物(EPS)分泌。

实际上，在污水处理中，电化学工艺由于其高效性和灵活性，故应用于微生物脱氮时得到了更多的关注。这是一个新的集成体系，即生物-电极反应器(BER)。Meller et al.(1992)最早使用生物-电极反硝化反应器，氨氮和硝氮去除率分别高达95%和85%。而且，三电极体系作为一个单室批式处理模式，有效提高了生物电极反应器总氮(TN)去除率。Kondaveeti et al(2013)采用一个三电极反硝化反应器，总氮去除率达88%，增加了反硝化菌的数量。在连续生物电极体系，通过调整电势平衡和自动补偿回路，稳定平衡工作电极，运用到生物富集的高电阻环境中，当前的反应几乎维持不变 (Yoon et al., 2007)。此外，Virdis et al.(2010)研究了单个三电极反应器中硝化和反硝化同步的潜在性。迄今为止，电化学技术与传统硝化反硝化相结合运用于处理含氮废水，已经取得了显著成就。然而，电化学工艺对厌氧氨氧化菌是否有促进作用还未得知。

第一次在三电极厌氧氨氧化反应器中，研究电化学技术对厌氧氨氧菌的影响。此外，本文的目的在于阐明其影响机制，也探究了胞外聚合物、细胞形态、关键酶活性和厌氧氨氧化菌生长速率的变化。

2 材料与方法

2.1 微生物和饲料媒介

厌氧氨氧化菌用于连续流实验起源于一个实验室规模的上升式厌氧氨氧化固定床反应器。采用荧光标记的原位杂交技术(FISH技术)监测,发现厌氧氨氧化菌KSU-1(AB057453.1)的数量占接种总生物量约70-75%。van der Graaf et al.(1996)阐明了微量矿质介质的组成。试验中主要媒介是氨和亚硝酸盐，以(NH₄)₂SO₄和NaNO₂的形式存在。进水氨和亚硝酸盐浓度控制在100和130mg/L。

2.2 连续流试验

在连续流过程中，采用两个完全相同的上升气流柱反应器，R1(控制反应器)和R2(生物电极厌氧氨氧化反应器)。阴极和阳极都采用碳纤维毡作电极（5times;10cm）。甘汞电极作为对照电极（参考电极）。此外，R1的墙体也设置了两个碳纤维毡，用于观察厌氧氨氧化菌生长到碳纤维毡的表面情况。有效体积约为0.5L，内径为5cm，高为25cm。两个反应器采用同一介质连续培养，进水除去了99.5%氮气，溶解氧维持在低于0.5mg/L。两个反应器运行湿重为50g的厌氧氨氧化菌，因此每个反应器的初始混合液挥发性悬浮(MLVSS)固体浓度都为4920mg/L。进水添加2M HCl，调节pH为7.0plusmn;0.2，水浴加热使温度维持在35plusmn;1℃。图S1为连续流试验的示意图。

2.3 分析方法

亚硝酸盐和硝酸盐浓度采用0.22mu;m孔隙膜过滤之后再用阴离子交换的离子交换色谱法(ICS-1100,DIONEX,AR,USA)法测得。NH₄ -N,MLVSS浓度根据标准法(APHA 1995)测得。使用数字酸度计(PHS-25，雷磁公司，中国)测定pH。溶解氧测定使用数字溶解氧测定仪(YSI,Model 55，美国)。EPS主要组成成分是蛋白质和多糖，提取方法参照Morgan 等(1990)。蛋白质含量确定根据Lowery 等(1951)，多糖测定采用苯酚硫酸法(Dubois 等，1956)。第188天时，在透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)下观察厌氧氨氧化菌样本，TEM和SEM观察采用Duan等（2012）描述的方法。

2.4 生物的提取和酶活的测定

首先，使每个反应器的厌氧氨氧化菌样本在转速为8000rpm和温度为4℃的条件下离心20min。其次，取2g细胞（湿重），用磷酸钠缓冲液(20mM,pH7.0)清洗两次，除去上清液后再称重。接着，向清洗过后的剩余物中加入20ml相同的缓冲液重新成为悬浮液，采用冷冻法使细胞溶解后，用超声降解法（超声波细胞破碎仪CPX 750，美国）设置的条件为225W，温度4℃，时间30min。细胞碎片在22000rpm和4℃的条件下离心30min分离。将上清液4℃储藏，用于细胞提取，可以决定蛋白质和酶的活性。蛋白质浓度的测定采用Bradford法（Bradford 等，1976），牛血清清蛋白（BSA）作为标准蛋白液。测定肼脱氢酶(HDH)活性依据Shimamura 等（2007）采用的方法，准混合物中细胞色素c的吸光度可在分光光度计（V-560 UV/VIS 分光光度计，日本分光）波长为550nm时增加。肼脱氢酶(HDH)活性表示为减少的细胞色素c/mg蛋白质/min的微摩尔。亚硝酸还原酶（NIR）活性鉴定以Hira 等（2012）描述方法为基础。硝酸还原酶（NAR）活性测定采用Meincke等（1992）描述方法，通过测定亚硝酸盐的消耗量得到。亚硝酸盐浓度在厌氧条件下反应10分钟后使用分光光度计测得。硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性的单位为减少的亚硝酸盐/毫克蛋白质/分的微摩尔。

2.5 定量聚合酶链式反应(PCR)试验

厌氧氨氧化菌的实时荧光PCR量化采用Primer pairs Amx 809-F 和Amx 1066-R (20)。反应体积为25mu;L，包含12.5mu;L荧光定量用的试剂即SYBRR染料预混好的extaq 酶(大连宝生物，中国)，0.4mg/mL牛血清蛋白，200nM每个引物的最终浓度，0.5 mu;L Rox参比染料和2mu;L作为样本的DNA提取物。每个样本分析3次。PCR过程如下：95℃加热2分钟进行变性，紧接仍然在95℃下每5s一个周期，连续40周期，随后在62℃下退火30s,最后以72℃延伸30s。解链曲线分析显示在温度87.0℃时仅出现一个峰值，没有检测到峰值与引物二聚体有关，并且没有检测到其他非特异性PCR扩增产物。质粒DNA浓度测定采用Nanodropreg; ND-1000紫外-可见分光光度计（NanoDrop 技术）。厌氧氨氧化菌16S rRNA基因拷贝数可以直接从提取的质粒DNA浓度计算出。一个已知拷贝数质粒DNA经过6倍系列稀释后，进行3组实时荧光定量PCR试验，可以生成一个外部标准曲线。

2.6 统计分析

本文中提到的所有数据为三组平行实验数据的平均值。采用Duncan多范围检验(SPSS 19.0)单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析，当p值lt;0.05时，具有统计学意义。

3 结果与讨论

3.1 连续流试验

首先，调节R2的工作电极与参比电极之间的不同电极电势差(EPDs)介于0.01V和0.32V之间，研究电极电势（EP）对厌氧氨氧化菌活性的影响。图1表明了两个反应器的脱氮性能。当电极电势差（EPD）为0.01V，两个反应器的脱氮效果几乎相同；当EPD提高到0.02V时，R2的总氮去除率呈小幅度的增加趋势。第18-32天，R2平均总氮去除率增加到60.6%，比R1高8.91%。由此可知，调节厌氧氨氧化反应器的电极电势能促进脱氮性能。此外，当EPD提高到0.04V，甚至是0.08V，R2的总氮去除率有持续增加的趋势。当EPD为0.08V时，R2的平均总氮去除率达73.5%，而R1稳定在60%。此时，R2的总氮去除效果最好。但是，当EPD超过0.08V，R1和R2的相对偏差开始减小。当EPD为0.16V时，R2的总氮去除率为72.5%，但是R1经过长期的驯化，平均效率提高到66%。而且，当EPD增加到0.32V时，R1和R2的平均总氮去除率又回到相同的水平。考虑到R2中的厌氧氨氧化菌在繁殖期前期具有较高的生长率（讨论后），0.32V是EPD的极值，可能会对厌氧氨氧化菌产生负面影响。根据连续流试验结果，生物电极厌氧氨氧化反应器在一定的程度上能提高厌氧氨氧化菌活性，如这项研究中EPD为0.02V-0.08V。

图1 在不同EPD下两个反应器脱氮性能的比较。R1，控制反应器，R2，厌氧氨氧化电极反应器。A，氨氮；B，亚硝氮；C，硝氮；D，氮负荷率（NLR）和氮去除率（NRR）。

控制进水基质浓度不变，缩短水力停留时间（HRT）提高两个反应器的总氮负荷率（NLRs），研究最佳EPD对厌氧氨氧化工艺的长期效果。如图2所示，R2的总氮去除率（NRR）相比R1有快速的增长。试验后期，两个反应器的NLRs在第188天增加到1.46times; 10circ;³g-N/m³/d，R2的NRR达到911g-N/m³/d，高出R1（791g-N/m³/d）25.3%。假设第62-98天（EPD为0.16V和0.32V）负面影响可以被消除。显然，使用最佳EP时，R2反应器表现出持续地脱氮性能。因此，可以推断出使生物电极厌氧氨氧化反应器处于适合的EPD有助于提高厌氧氨氧化工艺脱氮性能。

图2 两个反应器处于最适EPD为0.08V时脱氮性能的比较。R1,控制反应器，R2，生物电极厌氧氨氧化反应器。A,氨氮；B，亚硝氮；C，硝氮；D，氮负荷率（NLR）和氮去除率（NRR）。

3.2 胞外聚合物（EPS）分析

胞外聚合物，即大量聚集在细菌细胞外部的高分子聚合物，可以改变细胞表面的理化特性，因此对生物膜的形成和稳固有重要的作用（Tay et al，2002）。表1说明了长期试验中EPS的含量。随着反应器稳定运行，两个反应器EPS的总含量不断增加。但R2中EPS含量在180天时增加到了594mg/gVSS，分别是接种污泥和控制反应器在180天时的2.76倍和2.19倍。EPS是微生物膜的组成成分，是由各种不同厌氧氨氧化菌属分泌（Li et al,2014）。显而易见，在R2反应器中，调节EP能够促进EPS的分泌，加速厌氧氨氧化菌在碳毡电极表面生长。此外，

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