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污水厂废水中微生物的组成变化

Marija Kaevska¹ bull; Petra Videnska¹ bull; Petra Vasickova¹

摘要 对污水处理厂的监测对于其正常运行以及重新利用水是重要的，同时也避免了人类或动物病原体在我们环境中的可循环。本研究中的样品来自全面的废水处理厂，其中使用454-焦磷酸测序监测细菌群落的结构。该测到量高达104个细胞/ ml。鸟分枝杆菌副结核菌和亚种检测到多达103个细胞/ ml的血清，还检测到诺如病毒组1和2。我们的研究结果表明，监测和控制流出物中特定病原体的发生的重要性，主组合物在植物的不同部位各不相同。在流出物中，最常检测属于门弯曲杆菌，细菌杆菌，TM7和菌杆菌属的细菌。使用定量实时PCR检查分枝杆菌，鸟毒杆菌，诺如病毒，甲型和E型病毒的存在。 Mycobac杆菌属SP。 在流出物中检要是因为水被重复使用时对人体健康的负面影响。

介绍

废水的处理是基于通过实证研究确定的微生物混合物消除有机和营养污染物。 细菌群落的结构负责废水处理，特别是活性污泥中的污染物决定了处理的有效性，并且以前使用不同类型的方法进行了研究，这两种方法都是依赖文化依赖性和不依赖文化的。最近，微生物群落的组成最常见的是通过16S rRNA基因的序列研究，该基因目前被认为是研究复杂微生物种群的最有力工具。这些研究已经在不同的废水处理厂进行[17,26,27]。 已经提出，用于处理废水的细菌组成在植物中不同，尽管变化的程度尚未得到充分研究。在这里，我们描述了一个人口约为 40万居民的城市全面污水处理厂的微生物组成。

污水排放通常被监测粪便指标（大肠杆菌或肠球菌）的存在。然而，其他致病菌可能会从粪便指标中独立出现，并可通过河水在环境中传播。病原体消除对于可能的后续再利用水以及抑制病原微生物在环境中的传播是重要的[23]。分枝杆菌是新出现的水源性病原体; 然而，在水或废水中不监测其在人和动物感染方面的存在和潜在风险。然而，分子细菌在法国的污水处理厂被量化[16]。 作者发现，它们的发生并不是通常被监测的参数所预测的。

病毒也被发现与处理废水中的粪便指标无关[18]。此外，由于困难和繁琐的集中程序和培养，他们的存在可能被低估。病毒可能会对人类和动物健康构成风险，因为通过污水可以获得受污染的地面水[3,10]。

虽然已经对废水中的微生物组成进行了研究，但是缺乏关于特定病原体的复杂信息。这项工作的目的是确定捷克共和国全面污水处理厂的流入物，活化污泥和污水中的细菌组成。 另外的目的是使用定量实时荧光定量PCR（qPCR）测定流出液中分枝杆菌和诺维病毒，甲型肝炎和戊型肝炎病毒的可能发生和数量。

材料和方法

收集和处理样品

废水处理厂样品是从流入的活性污泥中获取的，这些污泥是从四个不同的反应器中取样的，回收污泥和废水。 每个样品包含在24小时内收集的混合样品（每30分钟收集样品）。 回流污泥是污水处理返回后进行进一步处理的浓缩污泥样品。 排除流出物样品后，将所有其他样品在50ml管中以10,0009g离心20分钟进行浓缩。 将二百五十毫克沉淀物用于DNA分离。 流出物通过0.22mu;m过滤器（Milli-pore，USA）过滤，用于测定细菌群落和分枝杆菌的存在。将过滤器无菌切割成四片，在DNA分离中使用一片。为了检测病毒而取样的流出物如前所述进行过滤[12]。

DNA和RNA分离和qPCR

如前所述[8]，使用市售的试剂盒（Power Soil DNA Isolation kit，MoBio，USA）从250mg沉淀物或四分之一的过滤器中分离DNA。 如Torvinen等人所述，使用qPCR检测DNA用于检测分枝杆菌 [22]。 基于由Slana等人描述的制备的质粒的校准曲线进行定量。[20]。 如先前所述进行鸟分枝杆菌亚种的检测[19,20]。

根据先前发表的方法进行RNA分离，逆转录和qPCR以确定甲型，E型和诺如病毒的存在[12,24]。

焦磷酸测序

DNA样品另外用于吡喃糖测定分析。使用了用于扩增16S rRNA基因V3和V4可变区的通用细菌引物[15]。引物侧面有标准MID序列和吡喃糖测定所需的标签。 PCR反应按照制造商的说明书（Qiagen，Germany）使用HotStarTaq Master Mix Kit制备，循环条件如下：95 LC 15分钟，然后在94 LC下进行30秒循环40秒，55 LC 55秒和72 LC 60秒，最后延伸步骤72 LC 5分钟。使用在1.5％琼脂糖凝胶上的电泳显现PCR产物，并使用QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）从凝胶中纯化。使用Quant-iT PicoGreen dsDNA测定（Thermo Fisher Sci-entific，USA）定量DNA，将等摩尔量的PCR产物汇合在一起。将混合物按照制造商的方案在454GS Junior Platform（Roche，France）上进行测序。使用QIIME软件分析序列[2]。质量修剪标准包括MID序列中的不匹配和引物序列中最多1个错配。得到的等级高于20的序列缩短为350 bp的相同长度，并用RDP Seqmatch进行分类，操作分类单位（OTU）的鉴别水平设置为97％。根据本研究中检测到的细菌计算分类组的相对丰度。

结果与讨论

我们获得了大约33,000个有效序列，其质量和长度足以进一步分析。 从四个罐中的活性污泥获得的序列非常相似，因此我们将其作为一个样本进行讨论。 观察到的物种数量在活性污泥样品中最高（2552），进水样品中最低（1098）。 在返回污泥样本中，我们检测到2194个观察到的物种，以及流出物1840.这一发现与其他多项研究一致，其中多样性是活性污泥中最高的[26]。 Lee et al [11]也发现活性污泥的多样性明显高于我们的结果，尽管我们没有进行统计分析。

返回污泥的样品与预期的活性污泥样品非常相似。 流入物，活性污泥样品（包括返回污泥样品）和流出物之间细菌群落的组成差异显着。

在流入物中，最常检测到的细菌属于门类Proteobacteria，Bacteroidetes，Fir-micutes和Fusobacteria（图1）。 这些发现与Lee等人所述的一致 [11]谁发现同样的门在流入的样本中占主导地位。 McLellan等人 [13]报道了大量的放线菌，我们在我们的样品中没有检测到。 在课堂上，我们的流入样品主要包含Ep-silonproteobacteria和Gammaproteobacteria，而Alpha和Betaproteobacteria以非常低的丰度存在。 也存在细菌（图2）。 这与Lee等人报道的结果一致 [11] 然而，叶和张[26]发现的统治阶级是delta;-变形菌，梭状芽孢杆菌和Gammaproteobac-特里亚。 这些差异可能是由于废水组成，气候带，工业排放废水类型或天气条件等因素造成的。

活性污泥样品表现出最高的细菌分类群的多样性。 最常检测到变形杆菌，细菌属，氯虫和硝烟菌。这些发现符合以前发表的报告[5,25]。在一级中，Betaproteobacteria，Sphingobacteria和Flavobacteriia占优势（图2）。 在叶和张最近的一项研究[26]中，活性污泥中的主要类别是Alphaproteobacteria和Actinobacteria。 使用荧光原位杂交，Muszynski等 [14]发现活性污泥中的Betaproteobacteria和Actinobacteria占主导地位，尽管31％的物种未确定。 其他作者发现beta;-变形菌和gamma;-变形菌活性污泥样品中占主导地位[9]。 这些差异可能是由于地点，废水处理厂的规模或使用的技术。 不同植物细菌组成之间的这种巨大差异可能有一个对治疗效果的影响，因为最近的研究发现分类学和废水处理细菌群落的活动之间有相关性[4,7]。活性污泥中存在的大多数细菌可能不参与废水处理的关键过程，正如我们的研究中的情况，以及其他[5,25]。我们研究中检测到的大多数序列属于变形杆菌门，不在活性污泥发酵中起作用。然而，这是有趣的发现，无论是流入物组成还是其他因素的结果，还有待进一步分析。

流出物样品的组成与活性污泥相似; 然而，有趣的是，它们具有增加量的放线菌种（图1）。统治阶级是beta;-变形菌，放线菌和TM7-1。 流出物的多样性高于流入物。 这可能表明沉积过程不完整，活性污泥中存在的细菌会进入流出物，随后在地表水中。

其他作者也检测出流出物中的病原性或潜在致病性物种如分枝杆菌和维布里诺菌种[1，26]。 我们使用qPCR，因为它是更敏感的检测特定病原体的方法，并且已经应用于检测分枝杆菌，鸟分枝杆菌亚型，诺如病毒，甲型肝炎病毒和E型病毒。在活性污泥样品和流出物（鸟分枝杆菌副结核分枝杆菌和M.a.Humissuis）中发现了鸟分枝杆菌复合物的成员。 检测量介于10至1000个细胞/ ml的废水之间（表1）。分析的所有样品均为分枝杆菌属的阳性，数量超过105个细胞/ ml。 这是根据以前的研究重点关注污水处理厂分枝杆菌的存活，这表明他们通过粪便指示剂细菌的发生无法预测去除[16]。 一般来说，流出物中病原体发生的研究很少见。Ibekwe等人 [6]使用焦磷酸测序法检测不同的致病菌，最常见的是分枝杆菌，梅毒螺旋体，军团菌和梭菌。 我们检测到流出物中诺如病毒组I和II的RNA。甲型和乙型肝炎病毒存在阴性样本。 最近的一项研究还报道了诺如病毒以及流出物中的其他肠道病毒[21]。

图1在污水处理厂的特定部位检测到的优势细菌门的相对丰度

图2在污水处理厂的特定部分检测到的细菌优势类别的相对丰度

表1

分枝杆菌的存在和数量 并利用实时定量PCR检测了废水处理厂不同部位的分枝杆菌亚种

MAH鸟分枝杆菌 hominissuis，MAA鸟分枝杆菌亚种,MAP鸟分枝杆菌-未检出副结核病

a数量计算为细胞/克沉积物

b数量以细胞/ ml流出物计算

我们的研究结果表明，监测和控制污水处理厂废水中特定病原体的发生的重要性，主要是由于对水的重复使用对人体健康造成的负面影响。 此外，它们通过地表水的传播可能会影响特定病原体的传播及其在环境中的存在。 许多早期的研究显示，粪便污染指标的监测不能取代特定微生物病原体的监测。

总之，高通量测序是研究废水处理过程中存在的各个分类组的总体丰度的有力工具。 研究因素需要综合考虑废水处理效果和病原体逃脱的可能性消除过程。 使用这种方法的未来研究需要确定污水处理厂细菌群落的动态及其与外部因素的关系。 然而，为了检测特异性病原体，qPCR是一种更合适的方法，其能够定量样品中的核酸。

致谢LO1218项目的结果是在捷克共和国教育，青年和体育部根据NPU I计划的资助下获得的。

参考文献

1.Bibby K, Viau E, Peccia J (2010) Pyrosequencing of the 16S rRNA gene to reveal bacterial pathogen diversity in biosolids. Water Res 44:4252–4260. doi:10.1016/j.watres.2010.05.039

2.Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, Costello EK, Fierer N, Pena AG, Goodrich JK, Gordon JI, Huttley GA, Kelley ST, Knights D, Koenig JE, Ley RE, Lozu-pone CA, McDonald D, Muegg

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