南海表层沉积物细菌多样性外文翻译资料

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南海表层沉积物细菌多样性

WANG Guanghua1,2, DONG Junde1, LI Xiang1lowast;, SUN Huimin1,2

1中国科学院南海海洋研究所海洋生物资源可持续利用重点实验室， 广州510301

2中国科学院研究生院，北京100049

摘要

研究与文献中16S rDNA测序结果证明了南海沉积物（SCS）的多样化，在24种细菌中海洋沉积物占有22种，然其站点分布非常不平衡。因此，本文研究了DGGE（变性梯度凝胶电泳）中15个样品的细菌多样性，从20到3 888米涵盖了广泛的沉积物类型。 DGGE结果表明，站间沉积物细菌多样性和多样性差异显着。样品中30种具有代表性和差异性的指印被回收测序，系统发育分析表明它们可能属于变形杆菌（alpha;-，beta;-，gamma;-，delta;-，ε-），浮霉菌门，厚壁菌门，绿弯菌门，酸杆菌门，放线菌，硝烟菌，芽单胞菌门，candidate division WS3细菌等，其中首次在SCS沉积物中检测到芽单胞菌门和candidate division WS3细菌。本研究还表明，在多样品分析中，基于DGGE的细菌多样性分析比传统的16S rDNA克隆文库更具潜力。

关键字: 细菌多样性 DGGE 海洋沉积物 南海

1 介绍

在过去十年中，由于独立分子技术的快速发展，对海洋沉积物微生物多样性和动力学的了解显着增加（Zhang 等，2008）。 根据数据外推，海洋沉积物中可能含有2/3的地球总原核生物量（Teske，2005），现在已经证明存在海底1626米有细菌存活（Roussel 等，2008）。

尽管16S rDNA培养依赖方法在拷贝数中的偏倚，某些序列的优先扩增以及来自环境样品的DNA的不同PCR效应（Zhang 等，2008; Roudi 等，2007; Von Wintzingerode 等. 1997），但传统的16S rDNA在微生物群落组成研究中仍然是不可或缺的。到目前为止，16S rDNA克隆文库，荧光原位杂交（FISH）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）是最流行的16S rDNA微生物群落组成研究方法。 16S rDNA克隆文库是最成熟和争议的（Roudi等，2007）。 FISH是一种敏感直观的方法，可以更合理地代表迄今为止的海洋环境微生物群落多样性（Ishii 等，2004），但仍然受到限制性探针和细胞壁异质性的限制（Pernthaler和Pernthaler，2007; Chen， 2006）。 DGGE是一种高分辨率的隔离手段，可以比限制性片段长度多态性（RFLP），特别是多个样品（Miletto等，2007）提供更多的显示效果。

了解特殊利基的物种多样性和利基之间的差距是一个根本的生态问题。 在诸如暗礁（Li 等，2008a; Uthicke and McGuire 2007; Xu 等，2004），槽（Kormas 等，2003），深海沉积物（Heijs 等， 2008; Xu 等，2008; Chen，2007），海底火山喷发（Chen，2007; Paraskevi 等，2005），南极或北极沉积物（Li，Yu 等，2006; Lysnes et 等，2004），等重点领域研究了细菌多样性。结果表明，海洋沉积物中细菌群落组成丰富，多样性差异较大。

在这项研究中，我们将根据文献中的16S rDNA克隆文库，一览DGGE中种类繁多的南海沉积物的细菌多样性（Sun 等，2008; Li 等，2008a，b; Zhang，2008; Xu 等，2004; Dai 等，2002）。 结果将有益于该领域的细菌生态和生物地球化学研究。

2 材料与方法

2.1 抽样

2006年9月7日至29日，“实验3号”在南海海域巡航由收集了301,307,408,708和X1的表层沉积物，2007年9月收录了X3，2007年5月13日至6月29日“实验3号”在南沙巡航时了X4，X5，8，303， 19，29，36，41和51的沉积物。沉积站的分布详见图1。 收集沉淀物后储存于-20℃。

2.2 DNA提取和纯化

将5克冷冻沉淀物悬浮于50ml无菌聚乙烯管中的10ml DNA提取液（100mmol / dm 3 TrisHCl，100mmol / dm 3 EDTA，100mmol / dm 3 Na 3 PO 4，1.5mol / dm 3 NaCl，1％CTAB，pH8.0）中（Zhou等， 1996），然后加入100mu;l2％蛋白酶K，在37℃下孵育30分钟，然后加入1ml 20％SDS，在55℃下孵育3.5 h。 将消化的混合物与等体积的氯仿—异戊醇（v / v = 24：1）混合，然后在Hettich通用320R离心机中以8000转/分钟离心15分钟。 将上清液与新管中的0.6体积异丙醇混合并在-20℃下冷却30分钟，然后以8000转/分离心，离心15分钟并除去上清液。 将DNA混合物溶解在小容量1times;TE（pH8.0）中，并根据手册在Takara DNA纯化试剂盒（中国，大连）中纯化。 回收的DNA溶解在40mu;ltimes;TE溶液中。

2.3 PCR扩增和DGGE

由于DNA模板中留下的抑制因子而使用巢式PCR。 第一和第二PCR的引物对分别为27f（5-GAGTT TGATC CTGGC TCAG-3），1500r（5-AGAAA GGAGG TGATC CAGCC-3）和338f（5-TACGG GAGGC AGCAG-3）， 518r [5 –GC clamp（CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG）ATTAC CGCGG CTGCT GG-3beta;]（Li，He等，2006）或338f，758r（5-GC钳CTACC AGGGT ATCTA ATCC-3）（Zhou 等，2007）。 反应体系为50mu;l，含有25mu;lExtaq（Takara），3mu;lDMSO，2times;2mu;l引物（10mu;mol/ dm 3），17mu;lH2 O和1mu;l模板DNA。 PCR程序为：95℃3分钟，94℃30秒，65-57℃30秒（温度每两个循环降低2℃，直到达到57℃的接地温度），72℃ C 100秒，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃100秒，20个循环，72℃10分钟。

DGGE用Ingenyphor U2times;2系统进行。通过等体积的醇，沉淀200mu;l二次PCR产物，然后重新悬浮于20mu;l溶液（V1times;TE / V10times;加载量= 3：2）中并加载到变性凝胶上。凝胶用梯度生成器和Ingeny电泳细胞制备。 DGGE条件为：首先，DNA片段338f-758r，聚丙烯酰胺浓度为8％，变性梯度含有0％-100％，0％-30％，15％-30％变性剂[100％变性剂对应于7mol / dm 3尿素和40％（v / v）甲酰胺]，在200V和60℃下电泳16小时;第二，DNA片段338f-758r，聚丙烯酰胺浓度为6％，变性梯度为20％-60％，在200V和60℃下电泳6小时;第三，DNA片段338f-518r，聚丙烯酰胺浓度8％，变性梯度30％-90％，40％-80％和50％-80％，在200V和60℃下电泳16小时。最后，用溴化乙锭染色凝胶15分钟，然后用Tanon 1600成像系统（中国上海）进行10分钟的摄入水摄影。

2.4 细菌系统发育分析

在338f和518r（无GC钳）中切割并扩增具有高度代表性的指纹图谱，并由Jingrui生物技术公司（广州）进行测序，然后发送到NCBI进行BLAST，下载序列进行系统发育分析。本研究确定的所有V3区域的16S rDNA序列均保藏在GenBank中，登录号为EU978951至EU979007。

3 结果

除了Sta 22 [（115°59.798E，7◦48.561N）西巴拉巴克海峡]，本研究方法的大部分站点均获得了DNA。 检索的DNA长度约为23 kb，样品中检出的DNA量差异很大。 在琼脂糖凝胶纯化后仍然存在抑制剂，所以模板DNA在16S rDNA扩增中被稀释，尽管如此，我们在样品中仍不能获得更均匀的16S rDNA扩增子。 所以我们进行了二次PCR，幸运的是这是有效的。

结果表明，338f至758r的片段具有较好的电泳行为，但多样性分辨率较低。因此，选择338f至518r的片段，而选择8％聚丙烯酰胺是因为片段长度小。 条件优化后， 选择8％聚丙烯酰胺中50％-80％变性梯度，在60℃、200V下电泳16小时，表明SCS沉积物的细菌多样性。

图1 表面沉积物收集站

DGGE谱图（图2）表明，SCS中沉积物的细菌群落组成非常多样。每个沉积物细菌群落根据其DGGE指纹可分为至少40组，并检测样品中群落组成的差异。一些指纹暗示了样本的深度信息，如12,18,22,23和27频段，但没有检测到海域差异，如北部到南部的SCS差异。 深度低于100米的站点29，36，708，X1和301在频谱中间部分具有类似的指纹风格，并且频带在局域网的较短区域内缩窄，而指纹产品22,23和27是特色深海样品，还有独特的产品，如14,28和30，仅在样品301中检测到。

图2 南海15个表层沉积物的细菌V3高频区DGGE谱

（在本研究中使用通用引物338f和518r，靶片段长度范围为172bp至198bp。 1times;TAE的聚丙烯酰胺浓度为8％。 脲和甲酰胺用作变性剂，凝胶变性梯度为50％至80％（7mol / dm 3尿素和40％甲酰胺为100％）。 用数字标记的条带用于测序和系统发育分析。）

不同的指纹产品被克隆和测序。 系统发育分析显示，再生指纹表明SCS细菌沉积物的主要成分类型，它们属于变形菌（alpha;-，beta;-，gamma;-，和delta;--），酸杆菌门，氯仿，放线菌，厚壁菌门，硝化螺旋菌门，浮霉菌门，芽单胞菌门，candidate division WS3 ，等等（图3和图4）。大多数克隆品的分类标准未确定，约14.04％所述序列是95％最大可信度下的GenBank序列，并且序列中42.11％在细菌域下未分类。

测序结果还表明，所有指纹图谱均为多态性，随机对每个条带上2-8个克隆品测序后，未发现重复序列。 在理论上，附近的系统类型应该具有相似的基本组合，但是DGGE指纹在本研究中不是特定的，所以在30个文字中只有两个（12和18）接近系统发育，分别属于酸细菌和阿尔法菌属。

图3 SCS沉积物DGGE条带的变形菌门克隆品的系统发生树

（在该树中使用了Mega 4.0中的最小进化算法，并且系统发生试验重复了10 000次。 梭状芽孢杆菌不在组群中。 本研究中的序列用数字x-x或xx-x标记，第一个数字是带数剪切，第二个数字是序列在该条带中的克隆同一性。 接着是Genbank的序列（登录号），用于菌株。）

图4 SCS沉积物DGGE谱带的其他门克隆品的系统发生树

（在该树中使用了Mega 4.0中的最小进化算法，系统发育检验重复了10 000次。 Nanoarchaeum equitans不在组群中。 本研究中的序列用数字x-x或xx-x标记，第一个数字是带数剪切，第二个数字是序列在该条带中的克隆同一性， 接着是Genbank的序列（登录号）。）

没有站点有整体的指纹序列（表1）。站点8,51和708的指纹谱具有较高的差异分布，而Stas X1,301和29具有相对较低的差异分布。变性细菌是测序克隆中的主要门，而alpha;-和Delta-变形杆菌是主要的亚门。 Stats 29,36,51,708和301没有发生Betaproteobacteria克隆发生，Stas 29,301,307,408和X3没有酸性细菌克隆发生，Stas 19,29，X1和303没有发现放线杆菌克隆，Stas 29,36 ，X5，X1，301和307没有发现氯仿克隆，Stas X1,301和X3没有发现厚壁菌门克隆，Stas X1和307分别没有发现硝基虫和浮霉菌。首次在SCS沉积物中检测到芽单胞菌门和 candidate division WS3细菌。在第51,708,301,307和408号检测到芽单胞菌门，而Stas 19,29,36，X1和301没有candidate division WS3克隆发生。

表1 不同站点的序列细菌克隆多样性分布

4讨论

4.1细菌多样性及其与环境的关系

SCS沉积物中的细菌非常多样化。 到目前为止，SCS中检测到22个门状沉淀细菌，其中20个由16S rDNA克隆文库检测到，它们是变形菌（alpha;-，beta;-，gamma;-，delta;-，ε-），浮霉菌门，厚壁菌门，氯仿，酸杆菌门，放线菌，硝化螺旋菌门，螺旋体，热微菌门，疣微菌门，脱铁杆菌门，CFB基，蓝藻，革兰氏专性厌氧杆菌，candidate divisionOP1，OP3 ，OP8，OP10，OP11和TM6（Sun等，2008; Li等，2008a， Zhang等，2008; Xu等，2004; Dai 等，2002），然后在本研究中，DGGE中的两个新门（芽单胞菌门和candidate divisionWS3）只有衣原体（Heijs 等，2008）和 恐球菌-栖热菌（Musat 等，2006）没有被检测到，分别是从东北地中海沉积物和北海的沙质潮间带沉积物中发现的。

变形菌门是文献中几乎所有克

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