丝状病毒Pf3的紫外共振拉曼光谱：特定于组装病毒载体的Trp 38的相互作用外文翻译资料

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丝状病毒Pf3的紫外共振拉曼光谱：特定于组装病毒载体的Trp 38的相互作用

摘要：II类丝状病毒Pf3在由43个残基的R-螺旋亚基的2630个拷贝构建的圆柱形衣壳中包装有6300个核苷酸的圆形单链DNA基因组。衣壳亚单位的单个色氨酸残基（Trp38）位于碱性C末端序列（... R WIK AQFF）内。 天然Pf3组件中Trp38的局部环境已经被使用229nm激发的紫外 - 共振拉曼（UVRR）光谱和荧光光谱研究了。Trp38在Pf3中表现出异常的UVRR特征，包括结构诊断拉曼带（763,1228,1370和1773cm-1），其在洗涤剂分解的Pf3，I类丝状病毒，大多数球状蛋白质或L-Trp水溶液中观察到的相应的拉曼标记物显著偏移。Trp38也观察到异常和高度淬灭的荧光光谱。这些独特的UVRR和荧光特征一起反映Trp38侧链与天然Pf3组装特异性的相互作用。关于Pf3的实验结果和来自已知三维结构的其它蛋白质光谱数据的支持促成了Trp38吲哚环的pi;电子与亚基C末端序列的碱性侧链特异性相互作用的模型。残留Arg 37和Lys 40是Trp38提出的阳离子相互作用的合理候选物。本研究表明该拉曼光谱可能是色氨酸的吲哚基电子系统和蛋白质中的正电子基团和它们的组合之间的相互作用的通常有用的探究。

噬菌体Pf3是感染含有RP1质粒的铜绿假单胞菌菌株的长（〜700nm）和窄（〜6nm）细丝。Pf3病毒粒子由包含在鞘中的约6300个核苷酸的共价闭合的单链（ss）DNA基因组组成，包含约2630个拷贝的44个残基的R-螺旋亚基（序列：MQSVITDVTGQLTAVQADITTIGGAIIVLAAVVLGIRWIKAQFF），加上细丝末端的少量蛋白质。如纤维X射线衍射所定义的Pf3衣壳的II级螺旋结构类似于丝状噬菌体Pf1(1)，但与I类噬菌体fd，f1和M13不同(2,3)。虽然I类和II类丝状噬菌体的装配途径是普遍关心的，但Pf3形态发生特别重要，因为Pf3衣壳亚单位缺乏N-末端前导序列。虽然I类和II类丝状噬菌体的装配途径是普遍关心的，但Pf3形态发生特别重要，因为Pf3衣壳亚单位缺乏N-末端前导序列(4)。Pf3的外壳亚基代表膜蛋白插入和易位探测机制的有吸引力的模型(5)。

最近在纤维X射线衍射分析的基础上提出了一种用于排列Pf3病毒粒子中外壳蛋白亚基的3.1Aring;模型(1)。然而，由于亚基侧链的局部环境和相互作用，包装的ssDNA基因组的结构，以及纤维电子密度图的分辨率相对较低，并且没有来自封装基因组的确定的衍射，成熟组装中ssDNA外壳蛋白相互作用的性质很大程度上仍未解决。DNA仅占病毒体总质量的约14％。 可以使用各种光谱方法，包括拉曼和紫外共振拉曼（UVRR）光谱法获得与纤维衍射分析中获得的结构信息互补的结构信息(6)。在噬菌体fd的情况下，取向纤维的极化拉曼显微光谱已经提供了相对于长丝轴线的涂层亚单位R-螺旋的平均倾斜角（16°）(7)。同时，极化拉曼测量也揭示了涂层亚单位的Trp 26侧链的吲哚环相对于长丝轴的空间取向(8)。在天然病毒体中，已经使用水溶液中流动取向fd的极化UVRR光谱来评估Trp 26(9)以及Tyr 21和Tyr 24(10)的侧链取向。具有适当选择的激发波长UVRR的实施(11)提供了在fd(12)和Pf1(13)组件中包装的ssDNA和外壳蛋白芳族化合物的另外的结构细节。这些和相关的拉曼应用程序可以更好地建模病毒细丝中的蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用(6)。

尽管最广泛研究的丝状结构（fd，Pf1和Pf3）相似的衣壳形态在相应的外壳蛋白中的芳族侧链数量和分布上有显着差异。因此，50个残基fd亚基包含最丰富的芳香族氨基酸结构，即2个酪氨酸（Tyr 21，Tyr 24），1个色氨酸（Trp 26）和3个苯丙氨酸（Phe 11，Phe 42，Phe 45）。与此相反，46个残基的Pf1亚基仅含有2个芳烃（Tyr 25，Tyr 40），而44个残基的Pf3亚基具有1个色氨酸（Trp 38）和2个苯丙氨酸（Phe43，Phe 44）。因此，预测亚单位包装的细节，特别是关于芳族侧链的相互作用的细节在三种病毒衣壳之间将显着不同。因为UVRR光谱对振动动力学和芳环的局部环境的探测较为敏感，该方法非常适用于丝状病毒组件中芳香族氨基酸侧链的局部相互作用的比较分析。本文利用该方法用来研究Pf3外壳亚单位的独特色氨酸残基（Trp38），并将其环境和Pf3病毒粒子内的相互作用与fd病毒粒子的独特色氨酸残基（Trp 26）的相应结构特性进行对比。

本研究表明，Pf3亚基色氨酸（Trp 38）的UVRR和荧光特征对于天然病毒体是不寻常的和特异性的。在分解的Pf3，I级丝状病毒粒子，大多数球状蛋白质或L-色氨酸水溶液（L-Trp）中未观察到类似的光谱标记。通过类比具有良好表征的三维结构的蛋白质，我们证明UVRR和荧光结果可以解释为涉及Trp38吲哚环和天然Pf3结构内的相邻碱性侧链的相互作用。之前并未通过拉曼或UVRR光谱鉴定出相似的色氨酸相互作用(14)。

材料和方法

样品制备。Pf3和宿主（铜绿假单胞菌，携带RP1质粒的菌株PAO1）和fd病毒和宿主（大肠杆菌，菌株Hfr3300）最初来自纽约公共卫生研究所的Loren A. Day博士 生长媒体（LB和MS）和L-Trp购自Sigma（St.Louis，MO）。 D₂O（99.9％）得自Aldrich（Milwaukee，WI）。

Pf3在LB培养基中生长在铜绿假单胞菌（PAO1）上，而fd在大肠杆菌（Hfr3300）中在MS培养基中生长。通过聚（乙二醇）沉淀，然后低速离心（10 000rpm）收集通过细菌膜挤出并进入生长培养基的成熟病毒颗粒。通过在10mM Tris（pH 7.8）中重复循环离心（60 000rpm）以纯化病毒颗粒，得到制备用于光谱分析的病毒溶液的沉淀。之前已经对用于光谱分析的丝状病毒的分离和纯化的进一步细节进行了描述(12-15)。对于UVRR光谱，将病毒以0.4mg / mL重悬于10mM Tris（pH 7.8）中; 对于荧光光谱，将Pf3在相同的缓冲液中稀释至2.7mu;g/ mL。通过紫外吸收光谱法测定Pf3浓度，假定在264nm处的病毒粒子消光系数为4.53cm2 / mg。在1mM，pH（pD）7.0下制备L-Trp在H₂O（D₂O）中的溶液。

UVRR光谱。对于UVRR光谱，将样品密封在定制设计的圆柱形石英池中，并以3000rpm旋转。使用连续波，倍频氩激光（Innova 300 FReD，Coherent Inc.，Santa Clara，CA）在229nm激发光谱，在样品池处保持1mW或更小的辐射功率。使用装备有棱镜预分散元件（McPherson Instruments，Acton，MA）的单格栅（2400g / mm）光谱仪（Spex 750M，Instruments，SA，Edison，NJ）分析90°下的拉曼散射和液氮冷却耦合器件检测器（Instruments，SA）。UVRR光谱仪的设计和性能特征的进一步细节已在之前描述(16)。

有效光谱分辨率为8cm ^-1以下。使用乙腈液体将拉曼频率校准为1cm ^-1。 每个频谱代表平均六个数据集合，每个数据集合在暴露1h或更少时获得。如前所述，除去干燥宇宙射线、水性缓冲液以及石英池的弱拉曼散射(16)。计算光谱差异以验证每个样品没有显示其UVRR光谱的显著时间依赖性。与以前演示的UVRR光谱仪设计的特征一致，在数据采集协议期间没有发生样品光分解(16)。UVRR数据采集通过紫外吸收光谱法也证实了样品完整性。

荧光光谱。从在10mM Tris缓冲液（pH7.8）中的2.7times;g / mL的天然Pf3溶液和在50mM SDS中的2.7mu;g/ mL的分解的Pf3上获得荧光发射光谱。使用295nm激发在Bowman Series 2荧光光谱仪（SLM Instruments，Urbana，IL）上收集数据。 激发和发射狭缝的带宽为2nm。

成果

拉曼光谱分配Pf3。之前提出了一些分配方案，其中包括几种丝状病毒的拉曼带，包括Pf3(15)。早期的Pf3分配方案已经基于更新的病毒成分的UVRR和非共振拉曼研究(11)，I类fd病毒粒子(12)，II类Pf1病毒粒子(13)和单位点突变体和fd的残基特异性2H和13C同位素(12,17-20)。因此，Pf3的229nm UVRR光谱中的拉曼谱带被明确地分配，如表1所示。（依作者要求，可将分配全面列出，包括在非共振拉曼和257nm激发的UVRR光谱中观察到的谱带）。

比较Pf3装配和拆卸的Pf3的UVRR 明显特征。含有色氨酸的蛋白质的229nm UVRR光谱预期由与吲哚环的振动模式相关的拉曼带主导(11,21)。这在表1中Pf3的证明。为了确定Pf3外壳亚基的唯一色氨酸（Trp38）的拉曼标记是否受组装状态的影响，我们将天然Pf3病毒粒子的229nm UVRR光谱与Pf3分解在50mM十二烷基硫酸钠（SDS）溶液中的相应数据进行比较，如图1所示。在SDS中，将外层亚基溶解在洗涤剂胶束内(22)。 图1的数据证明了具有病毒体拆卸的Trp 38吲哚环的局部环境的剧烈变化。这种拆装反应伴随的吲哚基正常模式名称和相应的波数变化如下：W18（763→757cm^-1），W17（874→878cm^-1），W10（1228→1238cm^-1），W7（1370→1360cm^-1），W3（1546→1550cm^-1），W1（1620→1616cm^-1）和W18 W16（1773→1767cm^-1）。为了解释这些结果，我们已经在许多其他蛋白质和模型系统中检查了色氨酸拉曼标记，如以下部分所述。

Trp 38的拉曼标记表明Pf3装配中的不寻常的吲哚环境。对于分解的Pf3亚基（图1，底部痕迹）观察到的Trp 38拉曼标记是典型的并且与许多蛋白质获得的UVRR和非共振拉曼数据一致（14,23,24）。相反，原生Pf3组件的Trp 38拉曼标记（图1，顶部迹线）是异常的。总的来说，763,874,1228,1370,1546,1620和1773cm^-1处的拉曼带表现出异常的吲哚环环境，显然是对Pf3病毒粒子结构的特异性。图2进一步证实，对于fd大衣亚基的Trp 26侧链，不存在该吲哚环境。图2的结果由Pf3和fd（15,18,25）的失谐拉曼特征证实。因此，虽然Pf3和fd的管状衣壳是由数千拷贝的小R螺旋亚单位组装而成，每个副单元每个亚基含有单个色氨酸残基，但仅针对Pf3观察到异常色氨酸拉曼标记的模式。实际上，fd的Trp 26拉曼标记与对于L-Trp水溶液观察到的类似，如图2的每个面板的底部迹线所示。这些结果汇总在表1中。

Trp38的荧光证实了Pf3中不寻常的吲哚基环环境。图3比较了天然Pf3组件和洗涤剂分解的Pf3（50mM SDS溶液）中Trp38的荧光发射光谱。结果表明，分解产生的荧光峰强度大幅增加（〜80％），最大发射波长（lambda;_max）呈现显着的红移（〜10nm）。对于拆卸的Pf3，我们发现，与H ₂ O中的氨基酸L-Trp相比，其中性疏水的吲哚环境的诊断（lambda;_maxasymp;353nm）lambda;_max=342nm，不如组装的病毒粒子的疏水性那么强（lambda;_max=332nm）（26）。 然而令人惊讶的是，Trp38荧光在病毒粒子组件中有非常强烈的淬灭。荧光和拉曼数据在Pf3装配中为Trp38显示不寻常的环境是一致的。

Pf3中Trp 38的侧链构象和本地环境的性质。通过检查先前建立的光谱相关性和可用的高分辨率蛋白质结构，可以推断出Pf3组装中特异性拉曼标记物和Trp38荧光特征的结构意义（24,26-28）。因此，1546cm ^-1处的拉曼标记（吲哚基模式W3）表明Trp38侧链扭转(由原子C^delta;1-C^gamma;-C^beta;-C^alpha;定义)(29)在自然的Pf3装配中具有ge;85°的大小。另一方面，对于fd的Trp 26，W3拉曼标记出现在1560cm ^-1处，表示本机fd组件（25）中的｜chi;^2,1｜asymp;120°。另外，对于拆卸的Pf3，我们发现对应于｜chi;^2,1｜asymp;90°的W3）1550cm^-1（图1，底部迹线）。因此，Pf3中对于｜chi;^2,1｜观察到的非常低的值（85°）反映了特异于天然病毒粒子的Trp38侧链构象。本实验值接近蛋白质（30）中空间容许的下限，与oslash;2,1提出的142°的值基本相似，基于Pf3的模型建立和纤维X射线衍射分析(蛋白质数据库条目1IFP)(1)。

874plusmn;1cm^-1（吲哚基模式W17，表1）的Pf3拉曼标记识别涉及Trp38（24）的N1H供体的相对强的氢键。通过Pf3拆卸，N1H氢键的强度明显降低，正如分解的亚基（24）中W17的波数值（878cm^-1）明显升高所证明的。Fd组件中Trp 26的N1H氢键（W17模式在876cm^-1）比Pf3组件中的Trp 38弱，但不如拆分的Pf3那样弱。我们得出结论，Pf3中Trp38的强N1H氢键状态也由组装的Pf3病毒粒子确定并且特异性。

Pf3组件中Trp38的UVRR特征的最显着的特征是以下四个拉曼带，其全部源于位于吲哚环部分内的振动：763（W18），1228（W10），1370（W7）， 和1773cm^{-1 剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料}

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