负载5-氟尿嘧啶的壳聚糖纳米粒子的制备及体内外缓释性能研究外文翻译资料

 2023-02-26 19:11:30

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负载5-氟尿嘧啶的壳聚糖纳米粒子的制备及体内外缓释性能研究

摘要

生物可降解的纳米药物递送体系的缓释放性能可用于提高药物在体内的缓释时间,因而这种药物释放体系被广泛应用于递送化疗药物,本文所制备的负载于壳聚糖的纳米粒子即具有上述优点。我们发现当5-氟尿嘧啶和壳聚糖的质量比为1:1时,纳米粒子的最大药物负载为20.13plusmn;0.0007%,包覆率为44.28plusmn;1.69%,纳米粒子的尺寸为283.9plusmn;5.25nm,zeta电动势为45.3plusmn;3.23mV。在体外实验中,所制备的壳聚糖纳米粒子不但可以一次性释放也可以实现缓慢释放。此外,壳聚糖纳米粒子对胃癌SGC7901细胞的抑制作用与5-氟尿嘧啶相同,对照组对癌细胞则没有表现明显抑制作用。在小鼠的体内药物分解动力学研究中,我们发现相比于5-氟尿嘧啶溶液,纳米粒子的AUC(0-t)、MRT(0-t)、t1/2z等指标都显著增大,这说明纳米粒子具有缓释作用。

关键词:5-氟尿嘧啶,纳米颗粒,壳聚糖,药物分解动动力学

前言

癌症对人类的健康和社会经济发展造成了严重威胁,也是全球最主要的公共健康问题之一。癌症治疗所面临的难题在于癌症在侵袭人体的早期存在容易转移、躲避免疫系统等生理学问题。当癌细胞在晚期被发现时,它已经在体内扩散并广泛分布,因而很难通过手术等治疗手段清除干净,且存在术后易复发等难题。治疗癌症的传统方法包括手术,激光治疗和化疗[1]等。而常用到的化疗药物包括5-氟尿嘧啶(5-FU)[2,3]、2,2-双氟胞嘧啶核苷[4]、阿霉素[5]等。5-FU已经被广泛的应用于癌症治疗[2],然而它的半衰期只有10-15分钟,且其活性持续时间短[6],频繁的注射限制了5-FU的临床应用。因此,我们迫切的需要一种治疗癌症的新方法。

纳米技术的发展为癌症的治疗带来了新的希望。可以通过将化疗药物负载于纳米携带体上来实现延长药物在活体内的释放时间的目的。近些年来,将化疗药物与纳米携带体复合技术取得了重大进展。巯基乙酸与谷胱甘肽连接的5-FU复合的金纳米粒子已经被用于研究直肠癌细胞的治疗,并且显示出持续释放的效果[7]。将抗化疗药物5-FU负载于PLGA共聚物上可以延缓药物的释放[8],研究显示5-FU负载的玻璃纳米粒子可以控制药物释放[9]。因此,包覆5-FU的材料仍然有很大的发展空间。

壳聚糖(CS)是一种通过甲壳素的脱乙酰作用获得的基本的多糖类物质,也是地球上除纤维素之外储量最丰富的天然生物高分子[10]。由于其低毒性、生物可降解性和良好的生物相容性,壳聚糖被广泛的应用于制药工业[11]。近些年,已有将壳聚糖用于化疗药物半衰期负载物的相关研究的报道,如壳聚糖包覆的磁性纳米粒子用于延长5-FU的释放[10]。通过离子凝胶法采用壳聚糖与藻酸钠制备的5-FU负载的纳米粒子与5-FU溶液相比具有持续释放的效果[12]。David等人报道槲皮素和5-FU负载的壳聚糖纳米粒子在体外实验中有明显缓释的效果[13]。尽管已经开发出了许多5-FU负载的壳聚糖纳米粒子,但只有一小部分被用于体外实验以考察其持续释放能力,对壳聚糖纳米粒子的体内效果的关注却明显不足。因此,壳聚糖纳米粒子作为化疗药物载体的缓释性能仍有待于进一步的研究。

在以往实验中,制备了藤黄酸负载的固态脂质纳米粒子,并且对其体内和体外的缓释性能进行了测试[14]。我们还制备了鹰嘴豆素A负载的纳米结构脂质载体并在小鼠身上研究其口服后的药物释放行为[15]。在这项研究中,我们制备了负载有5-FU的壳聚糖纳米粒子,并且研究了其缓释行为,包括体外释放和体内初期药物代谢动力学研究。

材料与方法

2.1材料

5-氟尿嘧啶颗粒(上海阿拉丁工业有限公司,中国上海),壳聚糖(脱乙酰度86%),三聚磷酸钠(Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.中国上海),3-(4,5-二甲基-2噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑溶液(MTT)(Sigma-Aldrich,德国,美国),二甲基亚砜(DMSO)(Sigma,美国),人类胃癌细胞(SGC-7901)(Cellbio 中国上海),实验中用到的其他试剂都是分析纯,所用的水需要两次蒸馏并去离子。

2.2 5-氟尿嘧啶壳聚糖纳米粒子的制备

纳米粒子的制备采用离子凝胶法。简单说,取25mg壳聚糖分散于1%的乙酸溶液中,调节pH至5.0。精确称量的5-FU粉末溶解于水中,制成25mg/L的溶液,然后用微注射器将5-FU溶液缓慢滴加至CS溶液中。最后,取2.5mL浓度为2.0mg/mL的三聚磷酸钠,在机械搅拌(600r/min)下加入到上述混合物中。室温下反应1.5小时。

采用同样方法制备不含5-FU的壳聚糖纳米粒子。

2.3包覆率(EE)与负载容量(LC)

采用超离心过滤法测量5-FU纳米颗粒的包覆率(EE)和负载容量(LC)。过程如下:取1.0mL5-FU-CN悬浮液于超过滤离心管(100kD,Amicon Ultra-4,Millipore,美国)中,在离心机(LC-4016型,Anhui USTC Instruments Co.Ltd,中国)中离心处理10 min(转速3500 r/min)。最后,对从离心管底部收集的游离药物采用高性能液体层析柱(HPLC,Shimadzu,日本)测量,紫外探测波长是265nm。采用WondaSil C18柱分析样品,柱温保持在30℃。移动相由甲醇和0.1%的磷酸混合物(体积比5:95)组成,流速保持在0.8mL/min。计算公式如下:

EE=(5-FU总量-游离5-FU)/5-FU总量times;100%;

LC=(5-FU总量-游离5-FU)/纳米粒子总量times;100%。

2.4纳米粒子的特点

CS-NPs和5-FU-CNzeta的粒子尺寸,多分散系数(PDI)和zeta电动势等参数由Zetasizer(Nano-ZS90,Malvern Instruments,英国)在室温下测定。每种样品在测试前都需要用蒸馏两次的蒸馏水适当稀释。

5-FU-Cn的形态特点由透射电子显微镜(TEM,JEM-2100,日本)测量。样品在实验前需稀释三倍。用于TEM分析的样品装载于铜电极上,在室温下晾干,在样品上滴加几滴质量分数2.0%(w/v)的磷钨酸以便于观察。

2.5 纳米粒子药物的体外释放

纳米粒子的体外释放过程如下:取1.0mL精确测量的纳米粒子悬浮液于透析袋中,透析袋的两端扎紧后置于提前准备好的PBS透析介质中。整个体系温度保持在37℃,放置在带有搅拌器的水浴中。在释放过程中,需定期更换透析介质,每个时间点释放的药物由HPLC确定。

2.6 体外细胞毒性研究

MTT法常用于细胞毒性测试。在这项研究中,我们选择胃癌SGC-7901细胞研究5-FU-CN的抑制效果。首先将细胞在96目的培养皿(2000细胞/目)中培养24小时,条件为37℃,5%CO2。之后将细胞分为三组,分别CS-NPs组,5-FU注射组和5-FU-CN组。未处理的细胞作为对照组,将细胞培养24小时、48小时和72小时。之后取20mu;L(5mg/mL)MTT溶液加入到每一目中,继续培养4小时,移去介质,每一目中加入150 mu;LDMSO,在490nm尺度下测量。细胞的相对活力由下式计算:

相对活力=测试组OD/对照组ODtimes;100%

2.7 药物代谢动力学研究

用于体内实验的SD小鼠(体重200~250g,安徽医科大学实验动物中心,中国合肥)实验过程符合相关标准,由安徽医科大学实验动物中心的实验室动物照料与使用委员会审核并批准,保证小鼠生存所需的水、食物及正常的生理节律。将12只SD鼠(6雄6雌)随机分为两组,采用静脉注射法,一组注射5-FU溶液,另一组注射5-FU-CN。每组的5-FU计量为15mg/Kg。注射后通过眶后静脉丛穿刺立即收集血液样本,在每一规定的时间间隔点(1,3,5,10,15,30,60,120,240,360,480,600,720min)从小鼠眼眦收集0.5mL血液样本,并对样本离心15分钟(3000rpm)。所得血浆在-20℃条件下冷冻储存。

2.8 统计分析

本文所用数据由GraphPad Prism6.02处理,结果表达为平均值plusmn;标准差形式,采用T-测试用于统计分析。认为P值低于0.05即为不同。

结果与讨论

3.1纳米粒子的特点

包覆率和药物负载是评价纳米粒子的两个主要指标,而增加药物剂量是提高这两个指数的主要方法。但是,其效果不是很好。当5-FU和CS的质量比在1:4和1:1之间变动时,包覆率变化不大(Pgt;0.05),但是药物负载随着5-FU的增加而增加(见表一)。当质量比进一步增加时,配方开始变动。因此,为获得最大的包覆率和药物负载,在之后的研究中我们选择质量比为1:1。此外,尽管5-FU-CN的包覆率不高,但药物负载高于之前的报道[15,16]

表1 CS与5-FU质量比不同的纳米颗粒的EE与LC

图一展示空白的壳聚糖粒子与5-FU负载的壳聚糖纳米粒子的粒径分布。CS-NPS的平均粒子尺寸是273.4plusmn;7.24nm,多分散系数是0.252plusmn;0.015;5-FU-CN的平均粒子尺寸是283.9plusmn;5.25nm,多分散系数是0.243plusmn;0.012。结合5-FU前后,纳米粒子的尺寸与PDI变化不大。也有报道指出粒子尺寸与胃肠与网状内皮组织有关[17,18]。此外,根据增强渗透效应和暂留效应,小粒子往往会在癌细胞区域聚集,而大粒子则没有此作用[16]。但是过小的粒子会诱发活性氧化基团进行氧化反应,从而导致脉管系统的炎症。但是可以认为本研究所制备的纳米粒子能在癌细胞区聚集并不会此类有害的效应。

图1空白CS-NP和5-FU-CN的尺寸大小(A),zeta;电位(B)和5-FU-CN的形态(C)

此次研究中,空白的CS-NPs和5-FU-CN分别是49.9plusmn;2.15mV,45.3plusmn;3.23mV。又已知纳米粒子的zeta电动势高于30mV,这意味着纳米粒子的稳定性更好,因为纳米粒子电动势的本质是粒子间的静电排斥[19],所以zeta电动势使CS-NPs和5-FU-CN具有良好的稳定性,并且正的zeta电位表明两种粒子的表面都是正电。纳米粒子的形态如图1C,透射电镜显示5-FU-CN纳米粒子呈球形,表面光滑。

3.2 体外药物释放研究

药物从纳米粒子当中释放模式有两种,一种是瞬时释放,另一种是缓慢释放。最初的爆炸释放是由于吸附在纳米粒子表面上的药物造成的。持续释放过程是由于运载物基体的分解和聚合物基体上的药物逐渐溶解造成[16]。体内的瞬时释放过程可以使药物浓度快速达到治疗的有效浓度,缓慢释放可以使体内的药物浓度保持在有效浓度范围内。5-FU溶液和5-FU-CN(PBS7.4)的体外释放类型如图2所示,很明显5-FU(图2,A)在0.7小时时已经释放91%,而5-FU-CN图(2,B)的释放过程包括瞬时释放和持续释放两个过程,结果是在0.7小时时释放76%,持续释放过程从0.7小时持续到8.0小时。因此,与5-FU溶液相比,纳米颗粒可以延长药物释放时间。解释药物释放的模型有0级动力学、初级动力学和Higuchi等式。经过拟合发现5-FU溶液和5-FU-CN的释放过程符合初级动力学模型(表2)。各自的公式为ln(1-Q/100)=-2.5813t-0.6425(r=0.9921)和ln(1-Q/80.4)=-0.6849t-1.9168(r=0.9273)。其中Q指累积释放量,t是释放时间。

图2 5-FU和5-FU-CN在PBS 7.4中的体外释放行为(A); 5-FU-CN在不同缓冲液中的体外释放行为(B)。

5-FU在PBS6.8(pH6.8模拟肠道流动环境)和PBS1.2(pH1.2模拟胃部环境)的释放行为如图2B,可知药物在PBS6.8和PBS1.2条件下的累积释放百分比都小于PBS 7.4条件,这可能是由于5-FU是酸性药物,在碱性条件下的离子化可以增大其溶解性[10]。此外,也可能由于壳聚糖凝的质子化氨基在酸性条件下可以在纳米颗粒的表面形成水

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