血小板丰富血浆（PRP）促进胎儿间质干细胞/基质细胞迁移和伤口愈合过程外文翻译资料

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血小板丰富血浆（PRP）促进胎儿间质干细胞/基质细胞迁移和伤口愈合过程

摘要：许多研究表明在愈合过程中存在高水平的生长因子。生长因子通过结合细胞表面受体起作用并有助于随后激活信号转导机制。伤口愈合需要复杂的生物和分子过程，包括不同类型的细胞吸引和增殖到伤口部位，分化和血管发生。更具体地说，各种细胞类型如内皮细胞及其前体，间充质干/基质细胞（MSC）或皮肤成纤维细胞（DF）的迁移在愈合过程中起重要作用。近年来，血小板富集血浆（PRP）在外科手术创伤和皮肤溃疡中的应用正在变得越来越频繁，因为它被认为可以加速愈合过程。 PRP应用后伤口局部富集生长因子刺激组织再生。在本文中，我们研究：（i）自体PRP对不同病因的皮肤溃疡的影响，（ii）PRP的蛋白质组学特征，（iii）羊水MSCs和DF在PRP提取物存在下的迁移潜能（iv）使用PRP提取物替代血清培养AF-MSC。考虑到其易于获取，PRP可以在多种治疗方法中提供有价值的工具。

关键词：PRP AF-MSC 治疗 细胞迁移

介绍

皮肤溃疡是血管病和糖尿病的常见并发症。它增加发病率，降低流动性，通常需要多次治疗。因此，有效治疗皮肤伤口需要充分了解愈合的生理过程。皮肤溃疡的最佳愈合需要一个精心策划的过程，并结合复杂的生物和分子过程，包括将细胞吸引到伤口部位，细胞增殖，分化和血管发生。许多研究表明，在各阶段存在高水平的生长因子，如血小板衍生生长因子（PDGF），成纤维细胞生长因子（FGF），血管内皮生长因子（VEGF）或表皮生长因子（EGF）愈合。生长因子通过与靶细胞的细胞膜上的特异性受体结合起作用，并且有助于激活这些细胞中的信号转导机制。实验证据加强了生长因子的施用可以通过诱导细胞迁移在愈合中具有有益作用的假说。

然而，许多慢性疾病，包括糖尿病，愈合过程被破坏。 近年来，富血小板血小板（富血小板血浆，PRP）的应用越来越频繁，能自然加速了愈合过程。 在血小板给药后，伤口部位生长因子的局部富集似乎是刺激组织再生的可靠方法。临床研究表明，PRP在骨移植中的应用导致伤口愈合加速，增加骨密度。 尽管支持PRP在组织再生中的贡献的临床研究的数量有限，但是可以使用用于收集和产生PRP和PPP（血小板不足等离子体）的不同协议和装置。

在伤口愈合过程中，已经观察到伤口区域中各种细胞类型（例如内皮细胞及其前体），干细胞或皮肤成纤维细胞（Dermal Fibroblasts-DFs）的细胞迁移的激活。 干细胞已被用于多种治疗方法，并且在糖尿病性溃疡和皮肤再生的情况下被认为有效加速伤口愈合。

间质干/基质细胞（MSC）代表细胞类型，根据许多研究，它在伤口愈合过程中具有重要作用。 MSC在不同发育阶段和成年期分别从不同组织分离，包括羊水（AF），脐带（UC），脐带血（UCB），骨髓（BM）和脂肪组织（AT）。

已经使用BM-MSC在治疗糖尿病皮肤溃疡方面取得了显着的效果。 直接机制尚未完全了解。 然而，在大多数情况下，MSCs被认为是通过以下方式为创伤愈合做出贡献：（i）分化，（ii）自分泌或旁分泌机制，或（iii）免疫调节作用。最近的研究表明，糖尿病性伤口的局部治疗 MSCs导致血管生成增加，通过旁分泌机制或分化发挥作用。

我们的研究小组已经确定了人类妊娠中期AF（AF-MSCs）的MSC，并进行了系统的表型和功能表征。 此外，以前的体内和体外实验方法已经表明，AF-MSCs位于胚胎和成体干细胞的状态之间。特别有趣的是这些细胞在体外不仅可以分化成中胚层（成骨细胞和脂肪细胞） ），但进入外胚层（神经细胞）和内胚层（肝细胞）系。 我们的研究结果表明，AF-MSC可以在膀胱癌的体内模型中用作抗癌药物的载体，也可以促进急性肝衰竭的组织修复，或者可以促进体内血管生成。

本研究中使用的AF-MSC表现出（i）高增殖率，其允许在体外获得大量的扩增细胞，（ii）在体内诱导血管发生的能力和伤口愈合性质。本文旨在表征PRP 表型，评估PRP对糖尿病患者溃疡的影响，并研究PRP对AF-MSC和DFs体外增殖率和细胞迁移性质的影响。

材料与方法

收集样品和制备富血小板血浆（PRP）和血小板血浆（PPP）

在事先书面知情同意的情况下，从患有皮肤溃疡的患者中制备了17份PRP和17份PPP样本。 PRP和PPP样品根据制造商的说明书（GPSreg;III，Biomet Biologics Inc）使用特定浓度过滤器（图1a）制备。对于PRP和PPP的制备，将54ml外周血吸入60ml含有6ml抗凝血柠檬酸葡萄糖溶液（ACD-A）（Citra Labs Braintree，MA，USA）的注射器。将样品置于过滤器单元的中心槽中，以3200rpm离心15分钟。离心后，通过重力分离血液样品成细胞成分，分别收集PRP和PPP。对于自体凝血酶的制备，使用适当的装置（Biomet Biologics Inc）将11ml外周血与1ml ACD-A溶液混合。将4ml TPD TM凝血酶试剂（Clotalyst，Biomet Biologics Inc）与12ml柠檬酸化的全血样品混合并置于25℃的培养箱中25分钟，然后将样品以3200rpm离心5分钟并收集自体凝血酶。对于在细胞培养物中使用PRP作为血清替代品，PRP最初在-80℃下进行深度冷冻，然后解冻并离心以除去细胞碎片，最后置于细胞培养基。

患者治疗

经相关同意书后，符合纳入标准的患者被分为单独的研究组。患有感染伤口，血液病或严重全身性疾病的患者被排除在研究之外。根据临床方案将自体血浆凝胶应用于伤口制造商指南（Biomet Biologics Inc）。伤口敷料每周至少更换3次，伤口处理直到伤口闭合或成功完成研究。自体血浆凝集物的制备和应用方法：首先，使用适当的过滤装置（GPS III，Biomet Biologics Inc）将20至60ml的外周血用于PRP制备。清洁伤口，清理坏死组织。将6毫升PRP与10升比例的0.6升凝血酶（也由相同的血液样品制备）混合。 PRP血小板凝胶通过喷雾置于伤口部位。然后，用半透膜覆盖伤口。

人类AF-MSC的分离和培养

涉及人类受试者的所有方案均由希腊雅典亚历山大医院伦理委员会和雅典大学医学院生物伦理委员会批准。所有样品均经每个人的知情同意收集。从4个AF样品中分离AF-MSC。在妊娠第15周至第19周的定期羊膜穿刺术期间进行房颤的抽样。使用22G针并在超声下，每个样品吸出10-15ml羊水。使用的样品来自用于产前诊断获得的过量体积的羊水。根据我们研究组的先前发表的方案培养AF-MSC。总之，将AF样品以1300rpm离心10分钟，将细胞沉淀重悬于富含20％（v / v）胎牛血清的Dulbecco改良Eagles培养基（DMEM，Sigma Aldrich Ltd，Gillingham，Dorset，UK）中（FBS，Gibco-BRL，Paisley，Scotland，UK）。将样品在37℃和5％CO 2下孵育约15至20天，直到出现第一个细胞群。纺锤形（SS）细胞群选自初始培养物（第0代），并如前所述进行传代培养。在第5-12节使用AF-MSC。

人DFs的培养

人类hDFs的三个样本由Suzanne M. Watt教授（英国牛津大学）精心挑选。 将DFs在补充有L-谷氨酰胺，青霉素/链霉素（Gibco-BRL）和10％（v / v）FBS（Gibco-BRL）的高葡萄糖和丙酮酸钠的培养基（DMEM，Sigma Aldrich Ltd）中培养。 第5-6段使用hDFs。

抗体和流式细胞术

通过流式细胞术检测PRP（n = 17）和PPP（n = 17）样品和AF-MSC（n = 4）（在富含PRP或PPP的培养基中培养后）。 抗表面标志物如：CD90，CD166，CD73，CD105，CD49e，CD29，CD62P，CD62E，CD45，CD34，CD14，CD31，CD50，CD64，CD44，CD1a，CD3，CD13或CD117 [Becton Dickinson（BD） San Jose，CA，USA]，然后是偶联于异硫氰酸荧光素（FITC）或藻红蛋白（PE）（DAKO有限公司DakoCytomation，剑桥郡，英国）的小鼠免疫球蛋白（IgG）的二次抗体。 流式细胞术分析使用Beckman Coulter Cytomics FC 500细胞仪（Beckman Coulter Ltd，Palo Alto，CA）进行。

用于PRP的抗体分析器阵列

将三个PRP样品在-80℃冷冻，然后解冻以进行细胞裂解，然后离心以在1200rpm下除去细胞碎片10分钟。 根据制造商的说明书，使用合适的分析仪抗体阵列（Profiler人类阵列目录号ARY007，R＆D Systems Inc，Minneapolis，USA）进行蛋白质分析。 使用Quantity One 4.4.1（Bio Rad Laboratories Inc）软件进行斑点检测的定量。 这些值被归一化为阳性对照。 数据以三次独立实验的平均值plusmn;SD表示。

实时定量PCR

将cDNA样品与合适的特异性引物和聚合酶混合物（PCR主混合物）（Applied Biosystems，No.4312704）混合。使用由Assays on Demand TM Gene Expression [Applied Biosystems Hs00742896_s1（oct-4），Hs01053049_s1 9（Sox-2））指定的引物和条件对Sox-2，Oct-4和Nanog基因进行TaqMan实时PCR， Hs02387400_s1（Nanog）]。使用ABI Prism 7000装置（Applied Biosystems）进行实时定量PCR，并使用ABI Prism 7700 SDS软件（Applied Biosystems）进行分析。通过如前所述的相对定量（Delta;Delta;Ct）方法分析数据。为了确定折叠表达差异，使用2-Delta;Delta;Ct公式。每个测定一式两份进行。数据表示为至少三次独立实验的平均值plusmn;SEM。然后，将补充有FBS的培养基中培养的AF-MSC中的Oct-4，Sox-2或Nanog的表达水平与富含培养基的培养基中的AF-MSCs中Oct-4，Sox-2或Nanog的表达水平进行比较PRP。使用Students t检验进行统计分析。

Transwell迁移测定 - 体外阻断实验

如我们以前的研究中所述进行体外细胞迁移测定。简言之，将补充有0.5％（v / v）FBS的DMEM中的2times;10 4 / 100ml密度的AF-MSCs或DF转移到孔径为8mu;m的transwell板的插入物中（Corning Life Sciences Ltd ）（图4a）。然后将AF-MSC分别移植16小时，并将DFs分别加入补充有：10％（v / v）FBS，10％（v / v）PRP或10％ （v / v）PPP。在适当的培养期后，用湿棉签从插入物的上侧除去未迁移的细胞。然后用多聚甲醛4％（wt / v）（Sigma-Aldrich Ltd）固定已迁移的细胞），并依次用苏木精和曙红染色（全部来自Sigma-Aldrich Ltd.）通过测量穿过孔膜的细胞核定量细胞迁移。细胞核的照片取自至少10个视野（20x ），使用装备有冷却CCD照相机和软件PCI（Digital Pixel，Brighton，England）的倒置显微镜TE300（Nikon Ltd，London，UK）。所有实验一式三份进行。使用t检验进行统计分析。

对于MMP9和PDGFR阻断实验，将MMP9抑制剂（Santa Cruz Biotechnology，Inc）或PDGF抑制剂SU6668（Calbiochem，Merck Chemicals Ltd，Nottingham，England）分别加入补充有10％（v / v）PRP的DMEM中。

MTS增殖测定

在下述条件下，将AF-MSCs和DF以10 ³个细胞/孔的密度培养在96孔板中5天.AF-MSC在补充有（i）20％（v / v）FBS ，（ii）20％（v / v）PRP或（iii）20％（v / v）PPP.DF在补充有（i）10％（v / v）FBS，（ii）10％ v / v）PRP或（iii）10％（v / v）PPP。 在第5天，向每个孔中加入适量的MTS试剂（Promega Ltd.，Madison，WI，USA），并根据制造商的说明书将细胞孵育3小时。 使用酶标仪ELISA（ELX 800; Biotek Inc，USA）在490nm记录吸光度。 使用以下公式计算增殖百分数：[（ODdayx-ODday0）/ ODday0times;100）]。 所有测定一式三份进行，并且每个实验plusmn;SEM计算平均值。 统计分析使用t检验。

结果

皮肤溃疡患者使用PRP敷料后的治疗进展

在这项研究中，在希腊雅典的“Amalia Fleming”综合医院普通外科系获得知情同意后我们回顾了17名接受PRP敷料治疗皮肤溃疡的患者的愈合进展。 其中11例为男性，6例为女性，平均年龄58.2岁（范围38-83岁）。 12例患者为糖尿病（70.6％），7例患有慢性肾功能衰竭（41％），其中2例需要永久性肾脏替代治疗。 五名患者有外周血管病史。

关于病因，其中2例患者手术伤口开裂，8例有神经源性溃疡，7例有缺血性或混合型缺血性/神经性溃疡。在分期方面，7例患者坏死期溃疡， 10例为渗出期（表1）。 每位患者均进行初步评估，其中使用简单的测量技术测量组织损失的大致体积。 以厘米为单位表示。 之后，开始用PRP敷料进行治疗（图1a）。 为每位患者创建了一个文档，其中包括溃疡类型（图1b），愈合进展（图1c）以及过渡到造粒和上皮化阶段的日期。在达到上皮化阶段后，大多数患者为使用其他类型的敷料转而使用不同的伤口愈合方法。

平均来说，组织损失量为34.06plusmn;4

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