分级多孔SN共掺杂碳纳米酶增强过氧化物酶样活性的总抗氧化能力生物传感外文翻译资料

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分级多孔SN共掺杂碳纳米酶增强过氧化物酶样活性的总抗氧化能力生物传感

Yifeng Chen, Lei Jiao, Hongye Yan, Weiqing Xu, Yu Wu, Hengjia Wang, Wenling Gu, and Chengzhou Zhu

DOI: 10.1021/acs.analchem

出版日期(Web): 2020年9月1日

2020年9月1日从pubs.acs.org下载

摘要

高活性碳纳米酶的设计和超灵敏生物传感器的进一步建立仍是一个待解决的问题。在此基础上制备了硫(S) /氮(N)共掺杂(SNC)层次多孔碳纳米酶。与n掺杂碳纳米酶相比，SNC纳米酶的米凯利斯-门顿常数(Km)更小，而更表明s掺杂在SNC纳米酶中不仅能增强其对底物的亲和力，而且也提高了它们的催化性能。这些结果可能是由于杂原子(S和N)的协同作用造成的，SNC纳米酶具有良好的类酶活性，可用于总抗氧化剂的比色检测以抗坏血酸为典型模型，其检出限为0.08 mM，结果表明，该检测方法具有良好的选择性和良好的检测性能，具有一定的商业应用价值。这一工艺作为高活性碳纳米酶的设计和其在结构上的应用奠定了基础。

关键词 硫(S) /氮(N)共掺杂(SNC)层次多孔碳纳米酶；碳纳米酶；抗坏血酸；生物传感器

邮箱: czzhu@mail.ccnu.edu.cn (C. Zhu).

教育部农药与化学生物学重点实验室，

华中师范大学化学学院智能生物传感技术与卫生国际联合研究中心，

武汉，430079，中国

介绍

材料的质量、电子传递提供了广阔的发展空间。另外，在碳纳米材料中加入了 P、 S、 B等杂原子的相互纳米酶是一种能够模拟天然酶活性的纳米材料，因其具有活性高、成本低、稳定性好、制备方便、易于修饰等优点而备受关注。由于Fe₃O₄纳米材料具有类似过氧化物酶（POD）的特性，人们已经发现，在纳米材料中，诸如过渡金属氧化物、贵金属、金属有机骨架以及碳纳米材料等都具有类似酶的活性。碳纳米酶具有优良的生物相容性和优良的耐热性，被广泛地应用于生物传感、疾病治疗、催化等方面。特别是以纳米酶为基础的生物传感技术，在小分子、离子、蛋白质、甚至杀虫剂等领域得到了广泛的应用。但是，由于其催化活性较低，限制了其广泛的应用。因此，研制高性能的碳纳米酶势在必行。

为了提高纳米碳酶的类酶活性，人们已经广泛地研究了氮（N）掺杂策略。例如，Wei和他的同事发现，通过氮掺杂可以提高碳纳米材料POD的特定活性。掺氮碳纳米酶的活性位点取代O₂和O^2-，使其具有优良的 POD活性。Yan等也发展出一种多酶类活性的碳纳米球，可以调控活性氧的浓度，并对肿瘤的催化作用进行研究。因此，要进一步改善碳纳米酶的催化性能，应以增加其内部活性为重点。多孔层结构有助于提高反应中心的曝光，为提高作用，可以提高其内在的活性。因此，将多孔结构与多种杂原子的掺杂相结合，将成为一种有效的改善碳纳米酶性能的方，为建立高性能的生物传感器提供了广阔的前景。

在此基础上，研究人员成功合成了具有S/N共掺杂（SNC）的分级多孔碳纳米酶。为了增加碳纳米酶活性位点的数量，采用硅胶、氯化锌等多孔诱导模板，可以形成具有丰富边缘缺陷的典型多孔结构。另外，采用硫脲作为硫源，通过 S、 N两种方法来改善纳米碳酶的活性。与N掺杂多孔碳（NC）相比，SNC纳米酶具有更小的米氏常数（Km）和更高的比活性，表明了S掺杂在SNC纳米酶中不仅可以提高其对底物的亲和力，还可以提高其活性，改善POD活动。

以上研究结果可能与 N、 S的协同作用有关，说明 S在 POD类化合物中具有更好的应用前景。如方案1所示，SNC纳米酶可以催化H₂O₂生成羟基自由基（bull;OH），生成的bull;OH依次氧化3,3′，5,5′-四甲基联苯胺（TMB）生成氧化TMB（ox TMB）。基于优越的POD活性，本研究利用抗坏血酸（AA）作为抗氧化剂，利用 SNC纳米酶对 TAC进行了检测。TAC方法在商品化中具有较高的敏感性和实用性。

方案1. SNC纳米酶过氧化物酶样活性示意图

实验部分：

材料和仪器：氨基葡萄糖盐酸盐从Heowns Co.Ltd.获得，TMB从上海阿拉丁生化科技有限公司购买，硫脲、氯化锌、乙酸（HAc）、乙酸钠（NaAc）、AA、H₂O₂和氢氟酸（HF）从新药业化学试剂有限公司获得，亚甲基蓝（MB）从MACKLIN购买，胶体二氧化硅悬浮液（SiO₂）由Sigma获得，透射电子显微镜（TEM）图像来自Titan G260–300。X射线光电子能谱（XPS）测量由Thermo ESCALAB 250XI（美国赛默飞世尔）进行。X射线衍射（XRD）表征由D8 ADVANCE（德国布鲁克）测量。使用DXR（美国赛默飞世尔科学公司）通过拉曼光度分析测量催化剂的缺陷水平。紫外-可见光谱数据由多模阅读器（瑞士Tecan Spark）记录。

SNC纳米酶的合成：在一个典型的过程中，将2g氨基葡萄糖盐酸盐、334 mg氯化锌和150mg硫脲共溶于20 mL胶体二氧化硅悬浮液（2g SiO₂）中。然后，搅拌溶液并冷冻干燥，所得粉末在流动氮气下以5°C/min的升温速率热解至所需温度900°C，并保持2小时。最后，通过HF（10 wt.%）去除模板后获得SNC纳米酶。为了进行比较，我们在相同条件下合成了Ndoped碳纳米酶，因没有硫脲，而为NC纳米酶。另外， SNC纳米酶是由SiO₂和ZnCl₂合成的。SNC纳米酶的制备方法为SNC-WZ，无需加入ZnCl₂。

AA检测：将5mu;LSNC纳米酶（1 mg/mL）添加到150mu;L HAc-NaAc缓冲液（0.1 M，pH3.0）中，然后依次添加50mu;L H2O2（100 mM）、50mu;L TMB（5 mM）、50mu;L AA溶液（0-5 mM）。在37°C下培养5分钟后，通过多模式读取器记录ox TMB在652 nm处的吸光度。

TAC分析：以AA为典型模型，对商业饮料（绿茶、冰茶、茉莉花茶和水果混合物）进行了TAC测定。为了避免超出 AA测试的线性范围，需稀释实际样本的浓度。TAC检测在与AA检测相同的条件下进行评估，但使用真实样本代替AA。将ox TMB的吸光度带入标准曲线，并转换为AA的毫摩尔当量，然后通过吸光度转换获得TAC值，并乘以稀释因子。最后，以AA L-1为单位表示样品中TAC的含量。

结果和讨论

图1：（a）SNC纳米酶制备示意图，（b-c）TEM，（c，插图）SAED模式，（d）HRTEM，（e）HADDF-STEM和相应的SNC纳米酶EDS图谱，（f）N₂物理吸附等温线，以及（g）NC和SNC纳米酶的孔宽分布。

以硅胶和氯化锌为成孔材料，氨基葡萄糖和硫脲为前驱体，采用一锅高温热解法合成SNC纳米酶，经HF蚀刻后，获得了分级多孔的SNC纳米酶（图1a）。制备的SNC纳米酶的典型TEM图像如图1（b）和（c）所示，其中清楚地显示了由二氧化硅纳米球填料形成的平均直径为16-20 nm的球形孔。SNC纳米酶的多孔性使其具有高暴露量的活性位点和丰富的边缘缺陷。图1（c）插图中所示的环状选区电子衍射（SAED）图案证实了石墨烯层的无序堆叠和SNC纳米酶的非晶态特性。如高分辨率TEM（HRTEM）图像（图1d和S1b）所示，NC和SNC纳米酶都显示出丰富的弯曲和短程无序碳条纹（红色箭头）。

结果显示， NC、 SNC纳米酶中存在大量的边缘缺陷，如裂纹边缘、孔洞缺陷等。通过37个高角度环形暗场扫描TEM（HADDF-STEM）图像和相应的能量色散光谱（EDS）映射（图1e），证明了C、N和S元素在SNC纳米酶中均匀分布。

此外，NC纳米酶的形态与SNC纳米酶相似（图S1）。制备的纳米酶在N₂吸附-解吸等温线（图1f）中的显著滞后回线表明，它们分别具有微孔和介孔特征，这两种特征源自高温下锌的蒸发和二氧化硅模板。N₂吸附-解吸等温线上的明显迟滞曲线显示，所制备的纳米酶分别具有由高温下的锌蒸发和二氧化硅模板形成的微孔和介孔结构。

NC和SNC纳米酶的BrunauerEmmett-Teller（BET）表面积分别为588.5和524.1 m² g-1。作为比较，SNC-WSZ和SNCWZ纳米酶的BET表面积分别减少到2和285.4 m² g-1（图S2），远小于合成的SNC纳米酶的BET表面积。

研究发现，由于SiO₂和ZnCl₂的存在，使其具有较高的表面和更多的暴露的活性位点。正如预期的那样，孔径分布图（图1g）表明NC和SNC纳米酶主要包含微孔和中孔。从N₂吸附等温线获得的总孔体积分别为1.488和1.422 mL g-1（NC和SNC纳米酶）。NC和 SNC的 TEM图象显示，掺杂第二杂原子对 NC和 SNC的形态没有明显的影响。通过对 NC纳米酶的研究，发现 S的加入使 SNC纳米酶表面的 BET表面和总的孔隙容积减少。纳米酶的多孔结构使其表面具有较大的比表面积和较多的边缘缺陷，从而改善了材料的电荷/质量转移，进而提高了催化剂的性能。这个结果是预料之中的，下面将会对此作进一步的论述。

图2：（a）NC和SNC纳米酶的XRD图谱，（b）拉曼光谱，（c）XPS光谱，（d）接触角，以及（e）N 1s的高分辨率XPS光谱。（f）SNC纳米酶sp²的高分辨率XPS光谱。

如图2（a）所示，纳米酶的XRD图谱显示出两个宽峰，中心位于21°和42°左右。这两个峰是由（002）和（101）平面的低石墨碳物质衍射引起的，表明所制备的纳米酶的结晶结构较差。

拉曼光谱用于评估纳米酶的缺陷程度。图2（b）中的拉曼光谱显示了约1310 cm^-1（D波段）和1570 cm^-1（G波段）处的两个峰。碳层的缺陷和变形通常与D带的形成有关，而晶体结构和石墨结构与G带密切相关。因此，碳纳米酶的缺陷程度可以通过D带与G带的强度比（ID/IG）来表示。将杂原子引入sp²碳框架将产生更多缺陷，然后增加ID/IG比。正如预期的那样，SNC纳米酶（1.37）的ID/IG值明显高于NC纳米酶（1.15），表明已成功合成了缺陷更大的碳基纳米酶。

如图S3所示，SNC-WSZ、SNC-WZ的活性比 SNC的 ID/IG值要低，说明 SNC纳米酶存在较多的边缘缺陷，从而改善了 SNC纳米酶的电荷/质量转移效率。

NC和SNC纳米酶的XPS光谱表明，SNC纳米酶含有碳、氮、氧和硫，而NC纳米酶含有碳、氮和氧（图2c）。值得注意的是，SNC的杂原子（N、O和S）含量约为7.95%，高于NC（7.62%）。如图2d所示，SNC纳米酶的接触角小于NC纳米酶，结果显示， SNC纳米酶的亲水性较好，且杂原子含量较高。从高分辨率C 1s光谱（图S4）可以看出，由于sp³杂交碳产生的缺陷，SNC纳米酶的全宽和最大值比NC纳米酶（1.52 eV）宽1.65 eV，这一结果与拉曼光谱一致。如NC和SNC纳米酶的高分辨率N 1s光谱所示（图2e），398.62、400.31、401.2和403 eV处的四个典型峰分别归属于吡啶、吡咯、石墨和氧化氮。此外，NC和SNC纳米酶中不同N物种的含量如图S5所示。与NC纳米酶相比，SNC纳米酶中N物种含量的变化可以忽略，但氧化态N除外，氧化态N可能是S的引入和硫氧化物的形成引起的。对于SNC纳米酶，S掺杂水平为0.15 at%。S的原子大于C，使其更难融入碳结构，这可能导致S含量相对较低。图2（f）显示了SNC纳米酶的高分辨率S 2p光谱，其中171.8和168.43 eV处的峰归属于C-SOX（x=2,3,4），而163.82和165.28 eV处的峰归属于C-SC结构。研究表明，硫原子与邻近的碳自旋轨道相结合，可以成功地实现 S、类噻吩的锚固。由此得出，S的加入能有效地增加活性位点，并能与基体形成较高的亲合性，从而改善其催化活性。

图3：（a）溶液中不同底物处理的反应体系的紫外-可见光谱，比较NC和SNC纳米酶的比活性（U/mg）（b）V_max和Km ，（c）、（d） 不同纳米酶在H₂O₂/MB溶液中不同培养时间的吸光度值。

本文采用 TMB作为基质，对 NC和 SNC两种纳米酶 POD的作用进行了研究，并用ox-TMB在652 nm处的吸收光谱进行定量反应。

正如所料，SNC纳米酶比NC纳米酶表现出更高的POD样活性（图3a）。另外，在 SNC纳米酶中，通过调整硫脲的用量来实现 S/N的最佳比例（图S6）。当添加的硫脲量为150 mg时，SNC纳米酶表现出最高的POD活性。此外，我们还进一步研究了添加模板（SiO₂和ZnCl₂）对催化活性的影响。如图S7所示，SNC纳米酶显示出比SNC-WZ和SNC-WSZ纳米酶更高的POD样活性。因此，纳米酶的分级多孔结构可以通过改善电荷/质量传递，进一步提高其催化性能。此外，还研究了pH值和温度对POD样活性的影响（图S8）。结果表明，NC和SNC纳米酶与辣根过氧化物酶（HRP）的pH值相

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