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在微流体方面光学成像技术及其应用

Jigang Wu,Guoan Zhengb and Lap Man Lee

微流体装置近年来经历了快速发展，并为许多生物医学和化学应用提供了芯片实验室解决方案。光学成像技术在用于从生物或化学样品观察和提取信息的微流体中是必需的。传统上，在微流体中的成像是通过台式常规显微镜或其他庞大的成像系统实现的。最近，已经开发了许多新颖的紧凑显微技术以提供低成本和便携的解决方案。在这次审查，我们提供了光学成像技术使用在微流体和他们的应用程序的概述。我们首先讨论包括显微镜和基于干涉仪的技术的庞大成像系统，然后我们专注于可以更好地与微流体装置集成的紧凑成像系统，包括数字式在线全息技术和基于扫描的成像技术。生物医学或化学中的应用也与特定的成像技术一起被讨论。

介绍

微流体是一个新兴领域，吸引了在生物学，医学和化学领域的重大研究工作。 微流体装置依靠微米级结构来处理样品，例如反应剂，细胞等。由于小尺寸（通常为几十至几百微米的微流体通道），微流体技术具有消耗较少样品和 对于分析过程具有更快的反应速率的优势。 光流体是光学和微流体的融合，应用光学技术在微流体设备。 自从2003年发明“光流体”一词以来，它已经成为一个日益活跃的领域。

在光流体领域，光学检测对于从微流体装置提取信息是重要的。 文献中提供了光学检测方法的评论文章，例如基于折射率测量，吸光度，荧光和拉曼光谱的那些。最近，对光学成像技术的研究兴趣日益增长，特别是紧凑型或芯片成像方法，其可以提供微流体通道中的样品的微观图像，其通常包含比其他检测方法更多的信息。 在这次审查中，我们将提供一个光学成像方法的调查，可以应用于微流体设备中的检测。 我们还将讨论这些成像方法的潜在应用。

在许多应用中，需要光学成像技术，特别是通过显微成像技术来观察微流体通道中的样品。在一些情况下，也使用基于干涉仪的成像技术，例如光学相干断层摄影术。一方面，常规显微镜和其他庞大的光学成像技术通常用于观察微流体装置。在这些情况下，微流体装置可以直接放入成像系统，其通常很好地发展。然而，常规显微镜和类似成像系统的庞大性质与紧凑的片上微流体装置不能很好地匹配。另一方面，重要的研究方向也致力于开发可以容易地与微流体装置集成的紧凑成像系统。小型成像系统可以分为两个不同的类别。在一个类别中，成像系统通常基于常规透镜成像来开发。它们被特别设计为与片上微流体装置兼容。在另一类中，无透镜成像系统被开发以摆脱透镜，以便制造更紧凑的片上系统。这些成像技术的示例包括直接阴影成像，数字列线全息术和基于扫描的技术，例如光学流体显微术。 Gurkan等人和郑的综述论述了一些用于即时护理测试和芯片级成像系统的无透镜成像系统，其也可以用于微流体装置。

微流体中的光学成像技术可以分为荧光和非荧光方法。 荧光成像对于观察可以用荧光团标记的细胞或细胞器非常有用。 然而，荧光成像系统通常比非荧光成像系统更复杂。 对于在微流体（例如常规显微镜）中使用的庞大的光学成像技术，实现荧光成像是相当简单的。 但对于一些紧凑或芯片成像技术，荧光成像不容易。 我们将在后面的章节中讨论各种光学成像系统的荧光能力。

值得注意的是，对微流体光学成像的研究不限于光学部分。 研究人员还研究了微流体部分以促进光学成像，特别是荧光成像。 这可以通过制造特殊结构来实现，例如等离子体激元纳米结构，零模式波导和子波长缝隙波导，以增强信号。 表面钝化策略也可以用于降低噪声，例如在表面上施加牛白蛋白（BSA）或聚（乙二醇）（PEG）。 Vasdekis等人的评论文章专门讨论这些技术以增强单分子成像，我们不会覆盖这些研究工作的细节。

这一审查的结构安排如下：在下一节，我们将简要概述在微流体中使用的庞大的光学成像技术。 然后我们讨论数字式在线全息技术，这可以实现不使用传统的透镜。 这之后是对基于扫描的成像技术的讨论，其中通过扫描样品或照明光来获取图像。 在结束这次审查之前，我们提出其他紧凑型成像系统，可以很好地与片上微流控设备集成。

庞大的光学成像技术

从微流体的早期发展以来，常规显微镜已经用于观察微流体装置。 使用常规显微技术的优点是成像系统得到很好的发展并且商业产品是可用的。 在这种情况下，成像系统和微流体装置不是集成的，并且通常彼此独立。 各种显微镜技术已应用于微流体，包括明场和荧光显微镜，相差显微镜，微分干涉对比（DIC）显微镜，激光扫描共焦显微镜和单分子成像技术等。 注意，在一些情况下，特别是对于荧光和单分子检测，微流体装置可以被特别设计以增强如前所述的信噪比（SNR）。 由于传统的显微镜是发达的，详细内容将不讨论在这次审查。

除了常规显微镜，基于干涉仪的成像技术也用于微流体。一个重要的例子是光学相干断层扫描（OCT）.OCT基于低相干干涉仪，并且已经被开发为用于生物医学成像的强大的成像模式.OCT的轴向分辨率通常约为10微米，比正常显微镜差。因此，通常OCT不用于获得微流体通道中的样品的图像。相反，其可以用于以光学多普勒断层摄影（ODT）或多普勒OCT的形式测量微流体通道中的流体的流速。使用多普勒OCT，可以直接测量微流体通道中的横截面流速，这对于其他成像技术通常不是直接的。 OCT可以分为时域和频域域系统，目前主要使用后者，因为其在信噪比（SNR）和成像速度方面具有优势。

多普勒OCT系统的典型设置如图1所示。图1（a），其中使用光谱域OCT。值得注意的是，多普勒OCT只能在其方向不垂直于光轴时测量速度。否则将没有多普勒频移。由于多普勒效应，OCT中的干涉条纹的相位将随着微流体通道中的流体流速而改变。因此，可以根据该相位变化计算流速。当微流体通道垂直于光轴时，检测到的速度将不包括主流。在这种情况下，可以精确地表征二次流速。注意，如图1（a）所示，流体通道有意地相对于光轴以小角度倾斜，以便减少来自顶表面和底表面的强的背散射。 Ahn等人使用光谱域多普勒OCT系统观察蜿蜒微通道中的二次流和混合。图1（b）表示微通道，图1（c）示出了它们的测量的示例。

图1（a）多普勒OCT系统的典型设置; （b）用于观察流体混合的蜿蜒方形微通道; （c）液体速度测量。 图像从参考。

除了微流体装置的强度图像，可以通过基于干涉仪的相位成像方法观察相变.相变通常由微流体通道中的样品或流体的折射率变化引起。与用于增强图像对比度的荧光或其它非线性成像技术相比，相位成像具有作为无标记方法的优点，因此不需要特别制备样品。常规相位成像技术通常是定性的，例如相位对比和DIC显微镜。最近，已经开发了各种定量相位成像技术.在观察微流体装置的情况下，可以定量测量样品的相变，并且可以在给定微流体通道的厚度的情况下转化为折射率的变化。例如，Lue 等使用Hilbert相显微镜观察微通道中的HeLa细胞，如图所示。这里，微通道用于限制活细胞，以便分离相位信号对细胞折射率和厚度的贡献。相位成像技术的应用的另一个例子是观察微通道中不同流体的混合，这在许多情况下是重要的，并且通常通过将染料添加到流体中然后观察颜色的变化来观察.在这种情况下，提供了一种替代解决方案。 Wu 等使用相位成像方法来观察微流体通道中的折射率变化，如图1所示。可以看出，然后可以通过相位成像方法容易地观察到具有不同折射率的两种类型的流体（这里是水和盐水）的混合。

图2微通道中HeLa细胞的定量相位图（彩条表示以弧度表示的相位）。 图像从参考。

图 3通过定量相位成像观察水（W）和盐水（S）的微流体混合和扩散过程。 图像从参考。

除了通过干涉仪测量相位之外，强度图像可以用于通过使用传输强度方程方法来计算相位图像。 描述了组合微流体和强度成像的良好实例，以使用聚焦堆积收集显微镜实现相位图像流式细胞术。 如图4所示，微流体装置相对于光轴以一角度倾斜。 这允许在样品流过微通道时在不同的焦点位置处采集样品图像。 然后可以使用这些图像来计算样品的定量相位图像。

像流速一样，微流体通道中的测量压力对于许多应用是重要的.微通道中的压力通常用外部压力传感器测量，并且难以精确测量局部压力。 Song 等介绍了可以同时测量微流体压力和流速的光流体膜干涉仪的技术。在它们的设置中，在微流体通道的顶部上建立空气间隙，其间具有聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜。 当PDMS膜由于微流体通道中的压力而变形时，空气腔的高度将改变。 在单色光的照射下，来自空气腔的顶部和底部的反射将干涉并产生随空腔高度变化的条纹。 然后可以使用条纹变化来确定PDMS膜变形并因此确定压力。

目前，传统的显微镜和其他庞大的成像技术仍然盛行在微流体的研究和应用。 它们提供了用于微流体的最通用的成像模式。

数字串联全息术

在线全息术表示是Gabor在1948年发明的无透镜显微镜方法。在Gabor的原始设置中，样品被放置在相干光源和照相板之间。 入射到样品上的光将被散射并干扰未受干扰的光。 成像过程包括两个步骤：1）在相机板（即，全息图）上记录干涉图案，以及2）用另一个光源重建物体图像。 使用全息方法的优点是可以同时记录并随后重建样品的强度和相位信息。 然而，使用另一光源用于重建阻止实时成像，并且因此使得该方法对于许多应用是不切实际的。 因此，自从它在20世纪40年代首次出现以来，它在显微成像领域只受到了有限的关注。

图4（a）是聚焦堆收集显微镜的示意图；（b）示意图的俯视图; （c），（d）个体红细胞和白血病细胞的聚焦堆。 图像从参考。

近年来，数字成像传感器的发展已经显着地改进和简化了在线全息术的过程。 可以使用个人计算机有效地数字地执行在线全息术的图像重建步骤。 因此，在线设置与数字记录设备的组合和数字重建过程（称为数字列线全息术（DILH））在过去几年中已经重新获得了很大的普及。由于DILH设置的简单性 ，它还可以与微流体装置无缝集成，从而在光流体学的上下文中创造新的机会。

DILH的典型方案如图5所示。 其中光源被放置在针孔的前面，并且样品（微流体通道）被放置在CCD / CMOS图像传感器的顶部。 使用针孔增加了光的空间相干长度。 来自针孔的电场称为参考场，表示为Eref（x，z）。 这样的参考场以振幅透射率t（x）入射在样本上。 我们注意到t（x）是一个复值函数; 其大小表示物体的光吸收，其相位表示物体引起的光程长度变化。

Eref(x,z0)t(x) = Eref(x)(1 Dt(x)) = Eref(x,z0) Esca(x,z0)(1)

其中Esca是样品感应的散射电场。在等式（1）中存在样本透射率的近似，即，t（x）＃1 Dt（x）。这种近似是基于一阶泰勒展开，并且它仅对弱有效捕捉对象。在该近似下，成像传感器（即，全息图）处的强度可以表示为

I=[Eref(x,z1) Esca(x,z1)] ²=[Eref(x,z1)]² [Esca(x,z1)]² Eref*(x,z1)Esca(x,z1) Eref(x,z1)Esca*(x,z1) (2)

其中最后两个项分别对应于实像和孪像图像。有两种策略来重建样本的图像。第一种方法是恢复等式（2）中的Esca（x，z1）。这是传统全息重建方法的数字版本，并且可以通过将参考场与全息图相乘并在距离z1 2 z0处传播场来实现。该算法是直接的。然而，在这种情况下不能分离真实和双图像。并且该方法仅在样品是每周散射时有效。第二种方法是直接恢复等式（1）中的Eref（x，z0）t（x），从而消除双图像问题。这可以通过由Fienup等人开发的迭代方法和其他研究人员实现.典型的图像恢复过程涉及光场在成像域z = z1（其中应用强度数据）和对象域z = z0（其中应用先验对象约束）。也已经开发了其他重建方法来去除双图像伪像。

图5用于微流体应用的数字串联全息显微镜的典型设置。 光源被针孔空间过滤以增加相干长度。 将样品（微流体装置）放置在光源和图像记录平面之间。 来自样品的散射波与来自光源的参考波干涉并形成用于数字记录的全息图。

DILH平台和微流体装置的组合对于不同的应用具有巨大的潜力。 Garcia-Sucerquia 等人首先证明了DILH用于微流控平台的应用。他们记录微流体通道内的微球和红细胞的三维轨迹，具有微米级空间分辨率和亚秒级时间分辨率。 这种平台的应用包括胶体悬浮液的研究，细菌附着和颗粒速度测定的研究。

DILH的早期发展基于使用激光源，其提供了极高的空间和时间相干性。然而，成像性能受到相干噪声（例如斑点和交叉干扰）的极大限制。 Repetto 等人首先为DILH平台采用了部分相干光源（LED）.通过使用部分相干光源消除斑点噪声和降低成本，为资源有限的应用创造了新的机遇。沿着这条线，Bishara 等人集成了基于LED的DILH平台与用于样品传输的微流体通道，称为全息光流体显微镜（HOM）.在该平台中，微流体通道被放置在CMOS图像传感器的顶部。使用LED作为光源，并且使用0.1mm的孔作为空间滤波器以增加相干长度。由样品散射的光与参考光干涉以在CMOS像素阵列上形成全息图。单个记录的全息图可以用于恢复样本的图像，具有由像素尺寸强加的分辨率极限。为了避免该限制，可以组合相对于彼此进行子像素偏移的多个全息图，以实现更高分辨率的全息图。然后可以使用该高分辨率全息图来恢复对象的图像，具有所示的微米级分辨率。图6显示了流过微流体通道的贾第鞭毛虫囊肿和桑树花粉样品的成像结果。这种技术有潜力通过执行快速细胞计数和表型提高光流体成像和分析的能力。

图6 Giardia lamblia囊肿和桑树花粉颗粒的HOM成像结果。 LR：低分辨率，SR：超分辨率。

尽管DILH方法的简单性和成本效益，但也有一些值得讨论的限制。首先，图像恢复过程依赖于样本的强加的对象支持。一般来说，它只对空间稀疏的样本工作良好。其次，由于停滞问题，在迭代阶段恢复过程中不能保证解。为了解决这些问题，具有各种相位提取技术的离线

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