使用微波辅助提取，随后通过纳米LC-ESI质谱法定量测定金银花中的绿原酸外文翻译资料

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使用微波辅助提取，随后通过纳米LC-ESI质谱法定量测定金银花中的绿原酸

Fengli Hu, Chunhui Deng, Yang Liu, Xiangmin Zhang

摘要

本文通过微波辅助提取（MAE）金银花中的绿原酸后，再通过纳米液相色谱 - 电喷雾离子化/质谱（nano-LC-ESI / MS）测定金银花中的绿原酸（CA）。作为金银花的新样品制备方法，微波辅助提取程序得到优化，并通过验证，与常规方法包括回流提取（RE）和超声提取（USE）比较。发现微波辅助得到在最短提取时间内具有最高提取效率（仅4分钟）的最佳结果。这里，绿原酸通过纳米液相色谱-电喷雾离子化/质谱基于其真实标准的校准曲线来确定，并研究了该方法的线性，检测限度，精度和回收率。结果表明，微波辅助和纳米液相色谱-电喷雾离子化/质谱方法具有良好的线性（0.991,0.8-20 ng mL-1），低检测限（0.5 ng mL-1），良好的精密度（RSD = 2.54％ ）和回收率（84.8％）。实验表明，微波辅助提取后的纳米LC-ESI / MS是一种用于金银花中绿原酸定量分析的快速可靠的方法。

关键词：纳米液相色谱-质谱法；绿原酸；微波辅助提取

1. 绪论

金银花，忍冬科植物的干花，是一种常见的中医药（TCM）。 它显示了广谱的生物和药理活性，如抗菌，抗病毒^[1]，抗氧化剂^[2]。 金银花含有绿原酸（CA），木犀草素-7-O-葡萄糖苷，挥发油，黄酮，皂苷，多糖和多酚化合物^[3]等。 绿原酸是金银花中的主要生物活性成分。 为保证金银花的质量，测量金银花中绿原酸的含量是有必要的。而在分析之前，需要从金银花中吧绿原酸提取出来。 回流提取（RE）经常用于常规中草药有效成分的提取，是最广泛使用的传统技术之一^[4-6]。 然而，回流提取是费力耗时的，并且需要大量的溶剂。 超声提取（USE）也适用于绿原酸的提取^[7]。但是，它没有表现出令人满意的提取效率。 因此，一种从中草药中快速、无溶剂、低成本地把绿原酸提取出来的技术在目前来说是备受期待的。

微波加热涉及基于微波辐射引起的传导和介电极化的内部加热^[8]。近年来，微波辅助提取（MAE）作为传统固液萃取方法的潜在替代品已经获得越来越多的关注，主要是由于大大节省了处理时间和溶剂消耗^[9,10]。与传统的加热-回流提取法相比，微波辐射可以加速细胞破裂，使植物样本细胞的内部温度升高和内部压力增加，这促进了样品表面保护膜的破坏^[11]，使提取变得更有效。 这项技术已被用于从不同植物基质中提取各种生物活性化合物^[12-17]。 在我们以前的研究^[18]中，微波辅助提取随后进行气相色谱 - 质谱（GC-MS）这项技术已经应用于中草药分析。最近，高效液相色谱（HPLC）的发展取得显着进步，已经应用于分离和分析中草药中的组分。 纳米液相色谱是一种新的强有力的分析工具，它的分析将在小内径（I.D.lt;300 m）的毛细管中进行，该毛细管含有通常在高效液相色谱法中使用的固定相，与常规分析方法相比，纳米液相色谱提供了几个优点，例如，在短时间内实现成分的高效率快速分离，使用小体积的流动相以及少量的包装材料^[19,20]和低样品稀释比。 然而，由于注射的样品体积小和在UV检测中使用的检测单元的路径长度短，所述方法未能证明其灵敏度符合标准。 纳米液相色谱与质谱的结合是增强方法灵敏度的有效途径。电喷雾离子化现在已成为液相分离技术在线耦合的最重要的电离技术，例如液相色谱与质谱^[21-23]。液相色谱和电喷雾离子化-质谱耦合的优点是：（a）电喷雾离子化是用于将带电物质从液相转移到气相中的技术上的一种选择，（b）连接技术具有从离子或小分子到大分子的广泛应用（c）电喷雾离子化-质谱允许检测源自高分子量分子的多种带电物种。因为其具有相对低的流速，液相色谱的典型纳米特征，同样起源于使用小I.D.列，使两种技术（纳米液相色谱-质谱）的耦合容易实现，因此，由于其具有高灵敏度和低检测限度，纳米液相色谱-质谱通常用于蛋白质组学^[24]，药物化合物^[25]的分析。在本研究中，采用纳米液相色谱-电喷雾离子化/质谱用于测定金银花的绿原酸。这是第一个关于用纳米液相色谱-质谱连接微波辅助提取的报告。本论文优化了微波辅助提取的参数，将微波辅助提取的提取效率与常规提取技术的提取效率进行比较。还研究了方法的线性，回收率，精确度和检测限度。

1. 实验

2.1化学药品和材料

甲醇，乙腈和甲酸是色谱级（Merk，Darmstadt，Germany）。 乙醇是分析级。蒸馏水通过Milli-Q系统（Milford，MA，USA）纯化。金银花购自中国上海的当地中药店。 绿原酸（纯度99.9％）购自中国药物和生物制品研究所（中国北京）。 离心机来自Christ（Osterode am Harz，德国）。

2.2液相色谱-质谱条件

纳米液相色谱-电喷雾离子化/质谱系统（LC-20ADvp纳米泵，SIL-20AC自动进样器，Shimadzu，Kyoto，Japan）配备有纳米电喷雾电离界面。填充有3.5 mu;m颗粒的Zorbax SB-C18柱（150mmtimes;75mu;m，ID）购自Agilent technologies（Santa Clara，CA，USA）。流动相由（A）0.1％甲酸， （B）乙腈 0.1％甲酸组成，在开始的1-16分钟用5-20％B梯度洗脱，在16-24分钟用20-40％B梯度洗脱，然后在1分钟内使B的含量快速升至100%，最后持续 4分钟。流速为300nL min-1。选择分别在离子监测（SIM）和扫描模式下进行质量分析。以正模式获得电喷雾离子化-质谱光谱。所有质谱在新型混合离子阱飞行时间质谱（Shi-madzuLC-MS-IT-TOF）上获得，所述质谱仪配备有以正离子模式10000 FWHM运行的电喷雾离子化源（ESI-IT-TOFMS）。使用标准材料三氟乙酸钠作为内标，通过标准品校正质量，获得准确的质量。分析条件如下：扫描范围m / z 200-650;喷雾电压 2.50 kV;检测器电压 1.65 kV;撇渣器电压 9.0 V; TOF区压力1.5times;10^-4 Pa，温度40℃;离子源温度 200℃;捕集冷却气体（Ar）流量 94 mL .min^-1;离子阱压力 1.8times;10^-2 Pa;碰撞气体（Ar）流量 43 mL .min^-1;离子累积时间 10 ms;前体离子选择宽度 3.0amu，选择时间 20 ms; CID冲突时间 30 ms; q = 0.251。

2.3标准溶液的配制

准确称取适量的绿原酸，然后溶解在甲醇中并稀释至1mg .mL -1。 标准溶液储存在负4℃下的阴暗处，发现其能稳定存在两个月。通过用水适当稀释上述标准溶液，制备一系列1到10mu;g.mL^-1标准溶液。

2.4比较提取程序和优化微波辅助提取参数

2.4.1回流提取

通过回流2小时，将1克干燥的金银花用20 mL 70％乙醇萃取两次。 然后将提取物在15,000 rpm离心15分钟。 将上清液通过0.45 mu;m尼龙过滤器过滤，然后直接注入高效液相色谱仪中。 分析三次重复进样计算平均峰面积以确定金银花中绿原酸的含量。

2.4.2超声波提取

将1g干燥的金银花粉末精确称重至烧瓶中，然后将20 mL 70％乙醇加入用玻璃盖密封的管中。将粉末在超声浴中萃取30分钟。 然后将提取物在15,000 rpm离心15分钟。上清液也通过0.45 mu;m尼龙过滤器过滤，然后注入高效液相色谱仪中。金银花中绿原酸的含量用三次重复进样的平均峰面积计算。

2.4.3微波辅助提取和优化微波辅助提取参数

家用微波炉在我们的实验室进行了改进^[26]。 微波炉用2450MHz单相输出700W。操作：将一克金银花置于50 mL烧瓶中，随后加入20 mL 70％乙醇。 用手剧烈摇动烧瓶中的内容物，然后以约400W的功率萃取4分钟。 提取后，将烧瓶冷却至室温，然后打开。 将提取物在15,000 rpm离心15分钟，然后过滤。 将1 mu;L稀释液注入高效液相色谱仪中。

2.5方法验证

2.5.1样品的校准曲线和定量

通过绘制绿原酸的峰面积（y）与绿原酸含量（x）来构建绿原酸的五点校准曲线。 用Origin 7.0软件计算斜率，截距和相关系数的回归参数。 由得到的峰面积比计算金银花样品中的绿原酸浓度，算出校准曲线的回归方程。

2.5.2重复性实验

通过纳米液相色谱-电喷雾离子化/质谱方法分析5次相同的提取物，以确定由于色谱条件（系统精度）引起的变化。 通过微波辅助提取的金银花中的绿原酸含量的分析来研究相对标准偏差（R.S.D.）。 用添加0.01 g 绿原酸的金银花研究绿原酸的回收率。 在所述样品制备程序下处理混合物并使用纳米液相色谱 - 电喷雾离子化/质谱分析。另外，计算绿原酸的检测限度（S / N = 3）。

3.结果与讨论

3.1优化高效液相色谱条件下的绿原酸的分离

在用乙腈，水和不同比例的甲酸进行几次试验后，获得了优化的色谱条件。 发现流动相中甲酸的存在对金银花中绿原酸的保留具有显着影响。 一旦使用1％甲酸代替纯水，将pH切换为4.0，然后延长绿原酸在流动相上的（保留时间），使用水时令柱子不会立即洗脱。 在该高效液相色谱系统中，乙腈百分比的增加降低了大多数化合物的保留。 随后，采用由1％甲酸组成的最佳梯度洗脱，出现良好的分离和分辨率，令人满意的峰形以及相对短的分析时间。最终，在29分钟内观察到的16个峰包括通过纳米液相色谱 - 电喷雾离子化/质谱获得的金银花的指纹（图1c，由MAE提取）。表1列出了在金银花提取物中分离的组分。通过比较保留时间和准确的MS光谱，组分7被鉴定为绿原酸。

3.2微波辅助提取和常规提取技术的比较

根据表1，在微波辅助提取的提取物中鉴定了约16个组分，而在RE和USE的提取物中的数目分别为8和9。它们的色谱图如图1所示。它表示通过微波辅助提取的分量更多。然而，两种不同的组分（18,19）仅在提取物中通过m / z 389.1和243.1的回流洗脱，而组分17仅通过USE提取。这种差异可能是由于在回流，超声波和微波加热期间的各种结构转变造成的。在RE，USE和微波辅助提取的提取物中有五种组分都被鉴定。这些组分的量在图1中进行比较。除了组分6，微波辅助提取对其他组分的提取效率最高。通过比较绿原酸（图2，组分7）的峰面积，结果显示微波辅助提取是绿原酸的最佳提取技术，因为微波辅助提取的提取值最大。这证明微波辅助提取技术对于金黄花中绿原酸和主要化合物的含量测定准确可靠。

3.3优化微波辅助提取程序

研究了微波功率和照射时间对提取的影响（图3）。在不同的微波功率（200,400和700W）和不同的照射时间（1,2,4和6分钟）下提取金银花，然后进一步离心。最后通过纳米液相色谱-电喷雾离子化/质谱分析。如图3所示，在微波功率为200,400和700 W时，绿原酸的提取效率随着曝光时间的增加而增加。然而，当照射时间大于4分钟时（而在低功率下，时间为2分钟），提取效率降低。这可能是由于其在长照射时间下发生分解。通常，较高的提取温度的优点是加速反应并减少绿原酸的反应时间。微波前功率对提取率的影响表示在图3中。实验结果表明，当正向功率从200W提高到400W时，绿原酸的提取率增加，然后在700W时产量降低。除了用1分钟照射的提取之外，用400W的微波功率提取能提取出更高的绿原酸含量与其他成分。因此，微波辅助提取的最佳条件是在400W的微波功率和4分钟的照射时间下进行。

3.4方法验证

我们使用外标法进行验证，因为它简单，快速及样品制备准确。 在精密研究期间，我们发现绿原酸的保留时间的重复性对所有解决方案是有意义的。通过分析一系列浓度的绿原酸标准样品来构建绿原酸的校准曲线，范围为0.8-20ng mL ^-1，并通过绘制浓度对峰面积（简图未显示）。 校准曲线在0.8-20ng mL^-1中显示出良好的线性。 回归方程为y = 2.82times;1010x 1.69times;107.数据的线性回归分析产生0.991的相关系数（R2）。进行一系列样品分析以验证该方法的性能。通过相同提取物的五次重复分析绿原酸的峰面积来评估组合微波辅助提取和纳米液相色谱-电喷雾离子化/质谱方法的重现性。 百分比R.S.D. 值为2.54％。 通过加标绿原酸的标准溶液，测量该组分的回收率。 加标绿原酸的量通过从加标前的草药中的量减去加标后的绿原酸的总量来计算。 加标实验重复三次，以获得加标后的绿原酸的平均量。用R.S.D的回收率为84.8％。 4.64％。 检测限度（LOD）为0.5 ng mL-1（S / N = 3）。当通过液相色谱-质谱在所选条件下分析金银花提取物的测试溶液时，使用校准曲线进行定量分析。

3.5应用于测定金银花组合药物中的绿原酸

分析了由金银花，黄芪和黄连组成的中药配方。 将溶于30mL 70％乙醇中的0.1g各种草药的混合物通过微波辅助提取以约400W的功率水平提取4分钟。 过滤和离心后，将1mu;l提取物注入纳米液相色谱-电喷雾离子化/质谱。 根据校准曲线计算绿原酸的含量。 组合药物的平均含量为1.35ng，R.S.D. 2.82％（n =

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