从人参中分离的内生细菌可促进生长、降低发病率并刺激人参皂苷生物合成外文翻译资料

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从人参中分离的内生细菌可促进生长、降低发病率并刺激人参皂苷生物合成

摘 要

人参（Panax ginseng C.A.Meyer）因其具有抗癌和其他药理作用的能够帮助治疗的人参皂苷而闻名。然而，其在植物中的低含量和化学合成的高成本使得人参皂苷在商业上不可行；因此，提高人参皂苷产量的利益是很大的。本研究从人参叶中分离到8株新的内生细菌，其中人参皂苷含量最高的微生物转化菌株为多粘拟杆菌（Paenibacillus polymyxa）。在田间试验中，通过叶面喷施和灌溉将多粘菌接种到人参植株上，提高了植株生长参数，降低了发病率，并增加了人参皂苷（Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rb2、Rb3和Rd）的浓度。这些结果表明，从人参中分离到的多粘拟杆菌是一种有益的内生细菌，具有生物防治特性，可以提高该药用植物的产量和质量。

关键词 内生菌；植物生长；生物防治；人参皂苷；微生物转化

第1章 绪论

内生菌存在于所有已知的植物物种中，并通过产生提供保护和保护的物质来帮助宿主最终提高植物存活率(Yu et al., 2010)，没有任何感染迹象或产生其他负面影响(Araujo et al., 2002; Sturz et al., 2000)。因此，内生菌是一种可能被开发用于医疗、农业和工业用途的因子 (Brader et al., 2014; Hardoim et al., 2008;Sturz et al., 2000).对植物的有益作用包括促进生长 (Vendan et al., 2010); 提供或调动氮和磷等营养素；生产生长调节剂，如生长素、赤霉素和细胞分裂素；以及通过内生菌介导的化合物和抗真菌代谢产物的从头合成来保护植物免受病原体的侵害(Hardoim et al., 2008;Joshee et al., 2007)有人认为，根际土壤中的微生物分离物可用于提高植物次生代谢产物的含量 (Hallmann et al., 1997; Saraf et al.,2014; Zahir et al., 2003)内生菌可以诱导药用植物产生大量次生代谢物。然而，全世界只有一小部分植物物种被研究出存在促进植物生长的内生真菌(Tiwari et al., 2013).

人参（Panax ginseng C.A.Meyer）是一种重要的药用植物，其人参皂苷具有医疗、药理、生理和生态效益。根据传统中医理论，人参补气、促进血液循环、改善脾脏和肺功能、静心安神，传统上被用作补品和延年益寿的灵丹妙药(Leung and Wong, 2010; The State Pharmacopoeia Commission of the Peoplersquo;s Republic of

China, 2010).大多数人参皂甙单体含量较低，尤其是稀有的人参皂甙单体，其价值较高，已知在心脑血管疾病的预防和治疗、肝脏保护、免疫调节和抑制癌症发生方面具有生物活性(Ackloo et al., 2000; Jang et al., 2008; Lu et al., 2009).。人参对环境的要求高于大多数其他药用植物，发病率是影响产量和质量的主要因素之一。因此，深入研究的主题是能够提高人参生长能力和活性成分含量的方法。

尽管人们试图用化学方法合成人参皂甙，但这种植物仍然是此类物质的主要来源，但较低的内源性水平使它们无法应用于商业中。微生物发酵是提高人参皂苷浓度和产量的途径之一(Dong et al., 2003).从土壤中分离的细菌内生菌能够改变人参皂苷Rb1、Rb2和Rc的浓度(Itiro et al., 1972); 黑曲霉（Aspergillus niger）、乌萨米曲霉（Aspergillus usamii）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）和明串珠菌（Leuconostoc paramesenteroides）通过Rd和F2从Rb1转化为Rh2(Chi and Ji, 2005)，通过拟青霉属229-7（Paecilomyces bainier 229-7）将Rb1转化成Rd(Ye et al., 2010)。微生物转化反应条件简单，成本相对较低，特异性强，副产物极少；因此，与酸催化反应等其他方法相比(Shibata et al.1966)，可广泛用于增强稀有的药理活性成分。

本研究探讨了一株分离出的人参细菌内生菌能否通过微生物转化提高植株中人参总皂苷的浓度。此外，在田间试验中对接种内生细菌进行了测试，以确定是否可以通过促进生长、降低发病率和增加稀有人参皂苷的浓度来提高人参的药用价值。

第2章 材料和方法

2.1.植物材料和试剂

健康、新鲜、持续种植1~4年的人参，从吉林农业大学药用植物园获得。人参皂苷标准品购自吉林大学（中国吉林）。高效液相色谱（HPLC）级乙腈和甲醇购自Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。蒸馏水使用Milli-Q系统净化（Millipore, Milford, MA, USA）。

2.2.细菌内生菌的分离

从田间生长的人参植株的健康和无症状叶片中分离出内生真菌。表面灭菌方法如下：将叶片在自来水下彻底清洗10分钟，然后在5%次氯酸钠中浸泡5分钟，然后用无菌水冲洗四次。在75%的酒精中浸泡30秒，并用无菌水冲洗四次后，

用无菌滤纸擦干每片叶子的表面。为了确认表面消毒过程是成功的，将最后一份200微升等份无菌水接种在固体马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，在28℃下培养48-72小时。然后用无菌研钵和杵在少量无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)中浸泡叶片组织，并加入石英砂来帮助破壁，将组织提取物样品（100 mu;L）接种到PDA培养基上，然后在28℃下储存3天。挑选不同形态的菌落，并在PDA培养基上重复划线，直到每个分离物的菌落形态达到同质。共分离纯化了8株内生细菌。

2.3.内生细菌的微生物接种筛选

内生菌筛选如下：装有60毫升水和和3g 4年生人参根粉（通过孔径为20–60 mu;m的筛网筛选）的250ml三角瓶，在121 ℃下一起高压灭菌20分钟；然后，将它们冷藏直到溶液达到室温。通过移液管将八个内生真菌样品（OD₆₀₀=0.5）中的总共1毫升转移到四个烧瓶中的每个烧瓶中；另外四个烧瓶装1毫升去离子水作为空白对照。所有培养瓶均在28℃下培养摇晃12天，然后在50-60摄氏度的水浴中干燥。使用改进的超声波辅助方法提取菌株、人参粉、高压灭菌人参粉（空白对照）和使用改进的超声辅助方法提取出的人参粉样品(Lee et al.,2011; Shi et al., 2010)，并使用香草醛/高氯酸法分析总人参皂苷浓度(Cao et al., 2011).菌株G表现出人参皂苷总浓度的显著增加，被选作进一步研究。

2.4. 16S rDNA基因序列分析

从过夜培养的培养物中分离出内生细菌，并使用先前公布的方法提取和纯化细菌基因组DNA(Mamlouk et al., 2011)经过一些修改。琼脂糖凝胶电泳检测分离DNA的质量和数量。通用正反向引物27f（5rsquo;-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3rsquo;）和1492r（5rsquo;-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3rsquo;）用于扩增菌株G中的16S rDNA基因。反应中总共使用了25ng细菌基因组DNA和每个引物的5pmol，在程序如下的热循环器中进行：95 ℃持续5分钟；35次循环，95℃持续30秒，55 ℃持续30秒，72 ℃持续1分钟；72℃培养10分钟。.用PCR试剂盒(Axygen Scientific, Inc., Union City, CA, USA)纯化扩增子，并由三工生物技术公司（中国上海）测序。使用基本的局部比对搜索工具（BLAST；美国马里兰州贝塞斯达国家生物技术信息中心[NCBI]）进行序列分析。

2.5.人参接种内生细菌后生长参数和发病率的测定

2011年至2013年在吉林农业大学进行了田间试验。1年生、2年生、3年生和4年生人参的平均重量分别为0.5plusmn;0.02g、1.3plusmn;0.05g、3.9plusmn;0.1g和17.6plusmn;0.3g。植株生长在相同的环境条件下，种植距离为10cm。细菌在PDA液体培养基中在轨道振动筛（28℃下160 rpm）上培养48小时，并在4℃下以3000 rpm离心10分钟获得细胞； 将颗粒重新悬浮在无菌盐水（0.8%）中，浓度约为10⁸菌落形成单位（CFU）/ml。用于接种的浓度如前所述(Timmusk et al., 2005; Yang et al., 2013).

将1、2、3和4年生的人参植株分为对照组（A1rsquo;-A3rsquo;）和治疗组（A1-A3）。对照组用蒸馏水处理，而处理组则用A1接种，叶面喷施（约10⁸ CFU/ml，50 ml/m²，喷洒在整个植株上）；A2灌溉（约10⁸ CFU/ml，50 ml/m²）；或A3，两者的组合（叶面喷施和灌溉为25ml/m²时约10⁸ CFU/ml），共24组(Yang et al., 2013).田间试验每年进行一个月，三年内重复三次。在喷洒期间，土壤表面和其他植物用塑料覆盖以防止污染。收获时记录每株植物的生长参数和发病率。病人参是指叶锈病和根抗流病。发病率按以下公式计算：

发病率=患病植物总数divide;受试植物总数*100

2.6.人参皂苷的提取与表征

人参皂甙的提取方法已在其他地方发表（2.3)，(Gao et al., 2012; Zang et al., 2011; Zhang et al., 2013)人参皂苷标准（Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3和Rd）已通过HPLC进行鉴定，使用反相C18柱（pinnacle，250mmtimes;4.6mm；内径5mm）(Restek, Bellefonte, PA, USA)。样本进样量为20mu;l，柱温保持在30℃。二元洗脱溶剂由乙腈（AN）和水（W）组成，梯度洗脱程序如下：0–24 min, 18% AN, 82% W; 24–26 min, 22%AN, 78% W; 26–30 min, 26% AN, 74% W; 30–50 min, 32% AN, 68%W; 50–55 min, 33.5% AN, 66.5% W; and 55–65 min, 38% AN, 62% W.

流速保持在1.0 ml/min，在203 nm波长处测量吸光度以检测人参皂苷。

2.7.统计分析

使用SPSS v.19.0(Chicago, IL, USA).对数据进行方差分析。在Plt;0.05时，采用邓肯检验对平均值进行比较，以确定两组之间在治疗中的显著差异。

第3章 结果

3.1.微生物接种内生菌含有高水平的人参皂苷

从人参中分离到8株细菌内生菌（A-H）。在接种后的植株中观察到人参总皂苷浓度的变化。经菌株G处理的人参总皂苷浓度最高，为56.48 mg/kg，与高压灭菌人参粉相比增加了24.8 mg/kg(表1).基于这些结果，选择菌株G进行进一步分析。

3.2.菌株G的菌落形态特征

菌株G的凸面、白色/奶油色圆形菌落在固体培养基（A1和A1rsquo;）上培养时均匀分布，为革兰氏阳性菌（B1和B1rsquo;），如图 1.

3.3.内生细菌16S rDNA基因序列分析

为菌株G获得的16S rDNA基因扩增子与多粘类杆菌（Parenbicillus polymyxa，登录号EU239165.1）中的部分基因序列具有99%的同源性(图2).将长度约1450bp的菌株G的16S rDNA基因序列提交给GenBank（NCBI）。

3.4.内生菌对人参生长和发病的影响

植物生长和发病率随着年龄的增长而增加，所有多年生药用植物也是如此(图4)。在所有年龄段，通过叶面喷施和灌溉处理的多粘菌植株的高度和重量增加最大，发病率最低。1年生、2年生、3年生和4年生植株的平均高度分别比同龄对照高38.44%、35.24%、41.90%和24.00%，而治疗组的平均重量分别比对照高31.64%、58.87%、46.70%和18.61%。同样，多粘菌处理的1至4年生植株的发病率比用水处理的人参分别低13.64%、17.67%、21.67%和27.34%。

3.5.内生菌对人参皂苷含量的影响

9种人参皂苷的校准曲线和相关系数如表2.所示，采用高效液相色谱法测定对照组（B1–B4，对应于用水处理的1至4年生植株）和治疗组（B1rsquo;–B4rsquo;，对应于通过叶面喷施和灌溉处理的1至4年生多粘菌植株）中植物的人参皂苷浓度(图4)。所检测的九种人参皂甙得到了很好的分离，并在55分钟内实现了基线分离(图4).

多粘菌处理的1～4年生人参植株的总皂苷浓度分别比对照植株高36.83%、44.52%、67.96%和79.44%(表3)。4岁组Rc浓度比对照组低54.24%，Rd浓度比对照组高308.01%。这些结果表明多粘菌能有效地改变人参中人参皂苷的浓度。

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