蚜虫雌激素相关受体控制糖酵解基因表达和繁殖力外文翻译资料

蚜虫雌激素相关受体控制糖酵解基因表达和繁殖力

原文作者 Woo-Ram Park^a,Da Jung Lim^b,Hyunkyu Sang^a,Eunae Kim^c,Jae-Hak Moon^d,Hueng-Sik Choi^e,In Seon Kim^b,Don-Kyu Kim^a,*

单位 ^aDepartment of Integrative Food,Bioscience and Biotechnolog，Chonnam National University,Gwangju, 61186,Republic of Korea

^b Department of Agricultural Chemistry,Institute of Environmentally Friendly Agriculture,College of Agriculture and Life Sciences,Chonnam National University,Gwangju,61186,Republic of Korea

^c College of Pharmacy,Chosun University,Gwangju,61452,Republic of Korea

^d Department of Food Science and Biotechnology,Chonnam National University, Gwangju, 61186,Republic of Korea

^e School of Biological Sciences and Technology,Chonnam National University,Gwangju,61186, Republic of Korea

摘要：蚜虫是农作物的主要害虫，根据光周期和温度等环境因素，进行有性繁殖和无性繁殖。核受体作为配体依赖性转录因子的独特家族，可以控制昆虫的发育和生长，包括其形态发生、蜕皮和变态。然而，蚜虫雌激素相关受体（ERR）的结构特征和生物学功能在很大程度上是未知的。在本实验中，我们克隆了绿桃蚜虫(Myzus persicae)，（Sulzer）（半翅目：蚜虫科）（MpERR）中编码ERR的全长cDNA，并证明了MpERR能够调节糖酵解基因表达和蚜虫繁殖力。系统发育分析表明，MpERR起源于与半翅目昆虫截然不同的独特进化谱系。此外，MpERR的AF-2结构域赋予了核定位功能和转录活性。MpERR的过表达通过直接结合其启动子中的ERR应答元件，显著上调参与糖酵解的限速酶，如磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的基因表达。此外，ERR缺陷的胎生雌蚜虫表现出糖酵解基因表达降低并且产生较少的后代的现象。这些结果表明，蚜虫ERR在糖酵解转录控制和繁殖力中起关键作用。

关键词：核受体；雌激素相关受体；转录；糖酵解；繁殖力；绿桃蚜虫

1.引言

核受体超家族（NRs）是一组配体依赖性转录因子，可调节与分子和细胞生理学相关的基因表达。然而，对于一些孤儿NRs，尚未鉴定出合适的内源性配体（Giguere,1999）。与其他转录因子不同，NRs被小的亲脂性分子激活，如激素，胆固醇和通过细胞膜扩散的脂肪酸。有趣的是，据报道，NRs与昆虫发育有关，包括形态发生，蜕皮，变态以及繁殖（(King-Jones and Thummel,2005;Siaussat et al.,2007）。这些研究结果表明，NRs是农业中害虫管理和控制的一个有吸引力的对象（(Palli et al.,2005）。

雌激素相关受体（ERR）亚家族由三个成员ERRalpha;，ERRbeta;和ERRgamma;组成，由于它们的配体结合结构域（LBD）的活性构象介导了受体和配体之间的结合，所以这些成员都被认为是组成型活性的（(Misra et al.,2017a）。ERR的配体非依赖性转录活性在很大程度上取决于它们的共调节剂和膜受体，它们能够识别内分泌和代谢信号（(Kim and Choi,2019）。在哺乳动物中，ERRs在多种生理和病理生理条件中起重要作用，例如代谢稳态，神经发育和肿瘤发生。ERRalpha;对线粒体生物合成和呼吸能力的调节以及心脏功能障碍至关重要，而ERRbeta;主要与胚胎干细胞多能性的维持有关（(Huss et al.,2015）。ERRgamma;是内分泌和代谢信号的下游介质，通过调节参与葡萄糖，酒精，脂质和铁代谢的特定基因的表达，在多种代谢途径中起主要作用（Huss et al.,2015）。在一些无脊椎动物中，例如昆虫，尽管编码ERR的单个基因（ERR亚家族的昆虫直系同源物）包含哺乳动物ERR的典型结构特征（Bardet et al.,2006），但该受体在生物学功能中的作用在很大程度上是未知的。最近，据报道，果蝇（Drosophila melanogaster）ERR（DmERR）是调节参与正常发育生长的碳水化合物代谢基因和参与男性生育力的生精基因所必需的（Kovalenko et al.,2019;Misra et al.,2017b;Tennessen et al.,2011）。此外，在成年雄蛾（Agrotis ipsilon）中，触角叶中的ERR（AiERR）表达对于雌性发出的信息素的反应是至关重要的（Bozzolan et al.,2017）。有趣的是，在蜜蜂（Apis mellifera）中，ERR（AmERR）表达在女王幼虫中升高，并且在幼虫脂肪体中营养和氧化代谢之间的关系中起主要作用（Santos et al.,2016）。这些发现表明，ERR调节控制昆虫形态和发育生长多样性的代谢开关。

蚜虫是以韧皮部汁液为食的半翅目昆虫，是农业，园艺和林业中最臭名昭着的害虫。有趣的是，蚜虫在昆虫中是不寻常的，因为它们通过由光周期和温度等环境条件触发的替代途径进行有性和无性发育（Le Trionnaire et al.,2008）。因此，蚜虫的大量种群和广泛分布归因于其离散的表型可塑性，称为多酚现象。在春季和夏季，雌蚜虫通过胎生孤雌生殖繁殖。然而，在深秋，胎生孤雌生殖的雌性开始在其后代内产生雄性和产卵雌性，以便进行交配和越冬产卵。最近，对有性繁殖或无性繁殖的蚜虫的转录组分析表明，生殖模式转变主要涉及卵子发生相关的基因表达，如Bicaudal-C，Nudel和Nanos（Gallot et al.,2012;Liu et al.,2014,2017）。然而，有性和无性繁殖模式的分子基础尚未完全了解。

最近涉及豌豆蚜虫（Acyrthosiphon pisum）的基因组项目有助于鉴定NRs，例如蜕皮激素受体（EcR），超螺旋（USP）和ERR（Christiaens et al.,2010;Consortium,2010）。EcR调节跨代豌豆蚜虫翅膀多态性，其中蜕皮激素信号传导的激活导致无翅后代的产量更高（Vellichirammal et al.,2017）。然而，蚜虫ERR的结构特征和生物学功能在很大程度上是未知的。在这项研究中，我们从绿色桃蚜虫（Myzus persicae）（Sulzer）（半翅目：蚜虫科）（MpERR）中分离出全长ERR cDNA，这是一种侵染全球作物和蔬菜的重要害虫。此外，我们证明了MpERR调节糖酵解和孤雌胚胎发生中的基因转录，以及无性胎生雌性的最终后代产生。这些发现揭示了ERR在蚜虫繁殖力的转录控制中以前未被认识到的作用。

2.材料和方法

2.1.MpERR克隆

根据制造商的说明，使用Tri-RNA试剂（Favorgen Biotech Corporation,Ping-Tung,Taiwan）从绿桃蚜虫中分离出总RNA。cDNA是根据制造商的说明，用TOPscript RT DryMIX dT18plus（Enzynomics，Daejeon，Korea）从总RNA（1mu;g）合成的。使用对应于ORF的5和3末端的引物从cDNA扩增MpER的全长开放阅读框（ORF），并使用EcoR I和Xho I限制性内切酶位点插入pcDNA3-FLAG载体中。MpERR cDNA的5和3未翻译区域（UTRs）是按照制造商的说明通过PCR（RACE-PCR）通过PCR（RACE-PCR）对cDNA末端进行5和3-快速扩增而获得的（Takara Bio Company，Clontech，Madison，WI，USA）。我们使用特定的RACE-MpERR（反向引物）和通用引物混合物（正向引物）用于5′-RACE-PCR，并使用特定的RACE-MpERR（正向引物）和通用引物混合物（反向引物）用于3′-RACE-PCR。用于MpERR克隆和RACE-PCR的所有引物都列在表S1中。

2.2.质粒和DNA构建

使用EcoR I和Xho I限制性内切酶将MpERR进行PCR扩增的ORF插入pAC5-FLAG载体中。将MpERR缺失结构，包括MpERR dH-LBD（1-348个氨基酸），MpERR dLBD（1-534个氨基酸）和MpERR dAF-2（1-1071个氨基酸），使用EcoR I和Xho I限制性内切酶亚克隆到pcDNA3-FLAG载体中。使用EcoR I和Xho I限制性内切酶将含有删除的AF-1，DBD和铰链结构域的MpERR LBD（535-1082氨基酸）亚克隆到pCMX-Gal4载体中。磷酸果糖激酶（PFK）（MpPFK-luc，minus;1021/ 31bp）和丙酮酸激酶（PK）基因启动子（MpPK-luc，minus;1972/ 17bp）从绿桃蚜虫的基因组DNA中PCR扩增，然后使用Mlu I和Xho I限制性内切酶插入pGL3碱性载体中。PFK ERRE mut-luc和PK ERRE1 2 mut-luc含有突变ERR反应元件（ERREs），通过位点导向诱变（EZchange Sited-Directed Mutagenesis Kit,Enzynomics）生成。先前描述了含有三个ERR结合位点（TCAAGGTTG）拷贝的Sft4-luc，含有五个Gal4结合位点拷贝的pFR-luc和pcDNA3-FLAG-MmERRgamma;（(Kim et al.,2012;Sanyal et al.,2002）。pcDNA3-DmERR由Lena Jendeberg博士提供。所有构建体均通过DNA测序得到证实。

2.3.双链DNA合成

根据制造商的说明，使用Ampliscribe T7-Flash转录试剂盒（Epicentre Technologies，Madison,WI,USA）合成ds绿色荧光蛋白（dsGFP）和dsMpERR来制备双链RNA（dsRNA）。简而言之，使用5′末端含有T7启动子序列的基因特异性引物对GFP（286bp）和MpERR（228bp）进行PCR扩增，然后使用T7 RNA聚合酶进行GFP和MpERR靶向dsRNA合成。用于GFP（dsGFP）和MpERR（dsMpERR）的dsRNA通过琼脂糖凝胶电泳和生物光度计D30（(Eppendorf,Hamburg,Germany）获得鉴定。用于dsRNA合成的引物列于表S1中。

2.4.细胞培养和瞬时转染

HepG2（人肝癌细胞系;ATCC，Manassas,VA,USA）和293T（人类胚胎肾细胞系;ATCC）细胞在Dulbecco的改良伊戈尔培养基（DMEM,high glucose,Welgene,Gyeongsangbuk-do, Korea）中培养，并补充10%热灭活的胎牛血清（FBS;Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）和1%抗生素混合物（penicillin-streptomycin;Capricorn Scientific,Ebsdorfergrund, Germany）。在37°C下，将细胞保持在含有5%CO2的潮湿空气中。Drosophila Schneider line 2（drosophila S2;ATCC）细胞在Shields和Sang M3昆虫培养基（Welgene）中培养，并补充10%昆虫培养基补充剂（Sigma Aldrich,St.Louis,MO,USA）和1%抗生素混合物（(penicillin-streptomycin;Capricorn Scientific）。细胞在室温下培养，无CO2补充。根据制造商的说明，使用聚乙烯亚胺（PEI;Polysciences，Inc.，Warrington，PA，USA）。通过添加适量的对照载体，将每次转染使用的总DNA量调节至1mu;g/孔。Nano-Glo载体（Promega，Madison，WI，USA）被用作内部对照。萤火虫荧光素酶活性被归一化为Nano-Glo荧光素酶活性。独立实验至少重复三次。

2.5.昆虫

将大白菜种子（(Heungnong Seed Co.,Korea）用70%乙醇表面消毒1分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗。将消毒的种子种植在商业营养土壤中（Nongwoo Bio Co.,Korea）。种子在25plusmn;2°C和60plusmn;5%相对

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