一种新的无标记免疫传感器

大孔有序的反蛋白石二氧化钛(TiO₂)

原文作者 Jianlin Li , Xiangwei Zhao , Hongmei Wei , Zhong-Ze Gu , Zuhong Lu

摘要：光子晶体传感材料已被证明对折射率的变化非常敏感。本文通过自组装技术制备了三维有序大孔(3DOM)(gt;50 nm) TiO₂反蛋白石薄膜。基于TiO₂反蛋白石薄膜，建立了用于无标记免疫传感器的光谱仪。使用人IgG/山羊抗IgG对3DOM TiO₂的传感性能进行了研究，结果表明3DOM TiO₂反蛋白石膜的灵敏度可以提高到1mu;gmL^minus;1 （相当于1.5 pgmm^minus;2） 蛋白质浓度检测限。3DOM TiO₂反蛋白石具有较大的内表面积、低荧光背景和独特的光学特性。这些特性表明3DOM TiO₂反蛋白石在无标记免疫分析中的可行性。

关键词：自组装； 反蛋白石； TiO₂； 无标记免疫传感器

1介绍

无标记免疫传感器在高通量药物的发现、疾病诊断、环境监测和食品工业领域的应用非常理想。无标记免疫传感器结合了免疫特异性、光谱或电化学技术的便利性等优点，无需分离步骤即可在未经处理的样品中有效操作。一般来说，无标记光学转导方法主要可分为两类：光学干涉法和表面等离子体共振（SPR）方法^[1]。在这些方法中，诸如抗体或配体之类的生物分子被固定在固体基质上，用于检测靶抗原或受体的存在。生物分子的有效固定是成功应用的关键特征之一。生物相容性微腔材料，如二氧化钛 ^[2-8]，最近已被证明是支撑基板的敏感传感模板，因为它具有较大的内表面积、良好的生物相容性和广泛的应用。微腔材料的光学和电学特性，如折射率、光致发光和阻抗，对多孔结构内生物或化学物质的存在非常敏感 ^[9]。

为了制备二氧化钛微腔材料，已经采用了几种传统的制备方法，包括蚀刻技术^[10–12]和溶胶-凝胶技术^{[3-5、8、13、14]}用来生成微腔结构。一般来说，蚀刻技术需要特定的设备和强酸或强碱溶液中的可控工艺。由于苛刻的加工条件，一些溶胶-凝胶法会导致酶活性丧失^[15]。此外，这些技术仅限于它们可以实现的最小特性内。另一种重要的制备二氧化钛微腔结构方法称为 TiO₂ 反蛋白石模板导向法，使用单分散乳胶球^[16-20]。该方法以单分散聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯自组装为模板。在二氧化钛前体渗入球体间隙后，通过煅烧或甲苯蚀刻去除有机模板。由于胶体微球的大小和薄膜的厚度可控，这种方法在普通实验室中是可行的，并受到了极大的关注。这些二氧化钛微腔作为各种气体^[21–24]、生物分子^{[4,5,8,11,25]}的传感器已被广泛研究。然而，用作生物传感器的 3DOM TiO₂ 反蛋白石结构尚未见报道。 3DOM TiO₂结构的蛋白质吸附、灵敏度、特异性和再生等传感特性尚不清楚。

本文采用反晶技术制备了3DOM TiO₂反蛋白石薄膜，并以此薄膜为生物芯片建立了生物传感器。蛋白质通过物理吸附直接固定在3DOM TiO₂基底的孔表面。 通过监测衍射峰位移的变化获得反射信号。结果将显示3DOM TiO₂反蛋白石用于自由标记生物分子检测的独特光学性质。

2实验

2.1材料和设备

本实验室合成了单分散聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)球。10% 15nm二氧化钛和6nm二氧化硅纳米颗粒，购自催化剂与化工有限公司（日本东京）。试剂级的硫酸（95%）、过氧化氢（30%）和十二烷基硫酸钠(SDS)购自南京化学公司（南京，中国）。本实验中使用的所有化学品都是分析级的。载玻片是来自上海玻璃公司（上海，中国）的产品。实验采用去离子化水(gt;18MOmega;)。人免疫球蛋白G（hIgG）、山羊多克隆抗人IgG（山羊抗hIgG）、FITC 标记的山羊抗 hIgG 和 FITC 标记的山羊多克隆抗体抗兔 IgG（山羊抗 rIgG）购自 KPL 公司（英国吉尔福德）。

由计算机控制的自动化平台^[26]作为提拉实验机械。提升速度可在0.1-70mu;ms^minus;1的范围内变化。反射光谱由带有反射探头 HR200-7（一根读取光纤周围的六根照明光纤）（海洋光学，FL，美国）的海洋光学 HR2000 光谱仪记录。

扫描电子显微镜(SEM)观察使用S-3000N模型（日立，东京，日本）进行。

荧光图像和光谱均使用配备 Nikon D1X 数码 CCD 相机和海洋光学分光荧光计（海洋光学，FL，美国）的荧光倒置显微镜（Olympus，东京，日本）收集。

2.2滑动玻璃处理

用于实验的载玻片首先浸入含有 30% (v/v₀) 过氧化氢和 70% 硫酸的溶液中过夜。 然后，用去离子水冲洗玻璃基板并用氮气干燥。

2.3垂直升降模板法制备薄膜

三维有序纳米多孔TiO₂、SiO₂ 和聚苯乙烯(PS) 反蛋白石薄膜的制备与先前报道的方法相似[7]。简而言之，通过提升方法将 PMMA 球体涂覆在玻璃基板上。PMMA 球体之间的间隙空间由含有5mM SDS的10% 15nm二氧化钛或6nm二氧化硅-纳米粒子水悬浮液填充。最后，在500℃下煅烧薄膜，以去除聚合物球并固化网络。温度以2°Cmin^-1 的速度从25°C升至500°C，然后以2°Cmin^-1的速度降至室温。对于PS反蛋白石膜，通过提升法将直径为310 nm的单分散二氧化硅球体（由 Catalysts amp; Chemicals Ltd. Co., 东京，日本提供）涂覆在玻璃基板上。聚苯乙烯-甲苯溶液充满胶体空隙，甲苯溶液蒸发，然后用4%的氢氟酸把二氧化硅球刻蚀掉。

2.4无标记检测

将制备的TiO₂反蛋白石薄膜用作反射干涉光谱的传感芯片。光纤光谱仪的探头在检测过程中垂直于反蛋白石薄膜的表面。

为了将蛋白质固定在 3DOM TiO₂反蛋白石薄膜的孔表面上，传感器芯片分别浸泡于pH 7.4的10 mmol L^-1 磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的各种浓度hIgG溶液。在4°C下过夜孵育后，传感器芯片用10mmol L^-1 PBS缓冲液（pH 7.4）冲洗3次。然后将传感器芯片用 10mmol L^-1 PBS 中的牛血清白蛋白 (BSA, 5mgmL^-1) 在室温下在 pH 7.4 下封闭 1 小时，以防止在后续步骤中蛋白质的非特异性吸附。随后用pH7.4的PBS缓冲液冲洗传感器芯片，并在室温下用含有目标分析物的样品填充1小时。然后用pH 7.4的PBS 缓冲液和去离子水冲洗传感器芯片，并在光学测量之前用 N₂流干燥。 使用Ocean Optics HR2000光谱仪对孔表面的蛋白质固定、BSA阻断和分析物结合进行原位分析。所有测量均在法向入射和恒定区域进行。

2.5蛋白质结合特异性测定

根据上述方法，0.5mgmL^-1 hIgG吸附在孔表面。芯片用5mgmL^-1 BSA封闭后，将芯片分别在含有10mu;L0.05 mg mL^-1山羊抗rIgG、FITC标记的靶抗体和 FITC标记的山羊抗 rIgG 分别在室温下作用1小时。然后将芯片在 10mM PBS 中洗涤3次。然后获得荧光光谱和图像。

图1 – (a)使用体积分数为 1 wt% 的 PMMA 悬浮液在 25°C 下通过提升法制造的 PMMA 蛋白石薄膜的 SEM 图像。PMMA球的直径为275plusmn;10nm，提升速度为0.8mu;m/min。(b) 填充有 15 纳米二氧化钛纳米颗粒的薄膜的 SEM 图像。

2.6TiO₂反蛋白石芯片的再生

抗原和抗体在不同的反蛋白石薄膜上发生反应后，用紫外（UV）光照射芯片。通过测量反射峰的位置来评价芯片的光催化性能。

3 结果与讨论

3.1有序TiO₂反蛋白石薄膜的制备

对于大多数反蛋白石薄膜应用而言，制造具有均匀形态的高质量胶体晶体薄膜至关重要。本文采用垂直提升法快速制作蛋白石模板。将单分散的PMMA球体(直径275plusmn;10nm)组装在载玻片上，形成一个高度有序的胶体晶体模板。扫描电镜显示，PMMA球体形成了紧密排列的立方结构(图1a)。胶体晶体的表面是平面的。 在 PMMA 球之间的间隙填充 10% 的 15-nm TiO₂ 水悬浮液后，该过程不影响均匀的膜厚度和分散胶体胶乳晶体(图1b)。这些图片表明我们采用提升法制备胶体晶体薄膜的工艺是可靠的。 在对提升速度、球体溶液浓度和溶剂浓度等条件参数进行优化后，这种紧密堆积的蛋白石薄膜可以均匀地延伸到几厘米大小。

图2-(a) 二氧化钛 (TiO2) 反蛋白石薄膜表面的 SEM 图像。在500^◦C条件下，用煅烧法去除PMMA球体模板。(b)二氧化钛 (TiO2) 反蛋白石薄膜的横截面 SEM 图像。

图2显示了通过煅烧去除PMMA球体模板后的二氧化钛反蛋白石的扫描电镜图像。图2a结果表明，在大面积内产生有序六边形阵列，可以分配到以面为中心的立方(fcc)对称的(1 1 1)平面。图2b显示了反二氧化钛膜的截面结构，表明其三维有序结构从下到表面延伸。孔隙之间的中心到中心的距离约为210nm。这个大小比模板中使用的球体要小15%。这种变化来自于在煅烧过程中二氧化钛网络的收缩。结果与之前的报告一致^[27]。大孔TiO₂反蛋白石膜的内表面积估计为27m²/cm³。相互连接的3DOM二氧化钛反蛋白石结构为生物分子提供了更大的表面积。更重要的是，通过改变微球大小可以灵活地控制孔径，这种方法对于昂贵的设备是不必要的，而且在普通实验室中很容易执行。此外，大孔二氧化钛由于具有较高的折射率(ngt;2.5^[28])和良好的生物相容性而受到特别的关注，这对光学传感器的灵敏度非常重要。

3.2生物传感性能

以人IgG 和抗人IgG 抗体作为模型系统来表征 3DOM TiO₂ 反蛋白石的生物传感性能。hIgG 是由两条重链 (Mw 50 kDa) 和两条轻链 (25 kDa) 通过二硫键连接形成Y样结构的蛋白质；hIgG 蛋白的平均直径为12nm，厚度为4 nm^[29,30]。我们直径为210 nm的微腔足够大，可以渗透IgG，并且比大多数蛋白质都大。因此，蛋白质不仅可以吸附在3DOM结构的表面，也可以吸附在微腔的内表面。在生物传感测量过程中，反射峰的位置可以通过布拉格公式^[30]预测：

其中n_TiO2 , n_protein, and n_void分别是 TiO₂、蛋白质和空气的折射率。TiO₂ 的值为 2.46，蛋白质的值为1.42，空气的值为1。蛋白质的结合可以产生衍射峰位置的偏移。

为了证明蛋白质可以吸附在微腔表面，将传感器暴露于10mu;L IgG溶液（浓度从 0.5到5.0mgmL^-1不等）。观察到光谱的红移。结果表明，hIgG蛋白可以吸附在微腔表面。光谱的红移随IgG浓度的变化，如图3a所示。检测到5mgmL^-1 IgG 浓度的最大位移为5.8 nm。对于相同的IgG 浓度（4.1 nm），位移最大值高于 PS 反蛋白石膜^[30]。这归因于二氧化钛的高折射率。另一方面，位移最大值接近于6.5nm的理论位移最大值，这是由（1）根据IgG层的12nm厚度来估计出来的。蛋白质吸附是基于 TiO₂ 多孔表面上带负电的基团与蛋白质表面带正电的赖氨酸和/或精氨酸残基之间的静电相互作用 ^[4,5]。与溶胶-凝胶法固定蛋白质相比，由于蛋白质吸附是在生理条件下进行的，蛋白质活性保持最大。

图3-3DOM TiO2反蛋白石薄膜生物传感器的性能：(a)红移与传感器上吸附的hIgG浓度的关系。(b)原位反射光谱显示了 hIgG 的固定、BSA 的阻断以及山羊抗人IgG在孔表面的结合。(c)红移对山羊抗hIgG浓度的依赖性。（更详细的颜色信息，读者可以参考文章的网络版本。）

为了进一步研究我们的生物传感器的特性，我们将二氧化钛微腔反蛋白石膜暴露在2.5mgmL^minus;1hIgG溶液中的10mmolL^minus;1PBS中，pH 7.4。在4℃过夜作用，BSA封闭和冲洗后，TiO₂微腔膜充满了不同浓度的山

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