ZmMs7对玉米雄性育性和显性雄性不育系统发育的分子调控外文翻译资料

ZmMs7对玉米雄性育性和显性雄性不育系统发育的分子调控

原文作者：Xueli An^a,b,1, Biao Ma^a,b,1, Meijuan Duan^c,1, ZhenyingDong^a,b,1, Ruogu Liu^a,b, Dingyang Yuan^d, Quancan Hou^a,b, Suowei Wu^a,b, Danfeng Zhang^b, Dongcheng Liu^a,b, Dong Yu^d, Yuwen Zhang^a,b, Ke Xie^a,b, TaotaoZhu^a, Ziwen Li^a,b, Simiao Zhang^a, Youhui Tian^a,b, Chang Liu^a, Jinping Li^b, Longping Yuan^d,2, and Xiangyuan Wan^a,b,2

单位：^aZhongzhi International Institute of Agricultural Biosciences, Biology and Agriculture Research Center, University of Science and Technology Beijing,100024 Beijing, China; ^bBeijing Engineering Laboratory of Main Crop Bio-Tech Breeding, Beijing International Science and Technology Cooperation Base of Bio-Tech Breeding, Beijing Solidwill Sci-Tech Co. Ltd., 100192 Beijing, China; ^cCollege of Agronomy, Hunan Agricultural University, 410128 Changsha, China;and ^dState Key Laboratory of Hybrid Rice, Hunan Hybrid Rice Research Centre, 410125 Changsha, China

摘要：了解雄性不育的分子基础，建立实用的雄性不育体系，对作物杂种优势利用和商业化杂交制种具有重要意义。本文报道了玉米雄性不育基因ZmMs7的分子调控及其在多物种显性雄性不育系统中的应用。ZmMs7在玉米花药中特异表达，编码一种具有转录激活作用的PHD指形蛋白，在绒毡层发育和花粉外壁形成中发挥关键作用。ZmMs7可与NF-Y亚基相互作用形成ZmMs7- NF - YA6 - YB2 - YC9/12/15蛋白复合物，该复合物通过直接结合至启动子区CCAAT box并激活靶基因的转录表达。通过花药特异性启动子p5126在玉米中诱导ZmMs7提前表达，可导致显性完全雄性不育，但转基因植株的营养生长和雌性生育能力并不受影响。不仅如此，在p5126-ZmMs7玉米株系中提前表达ZmMs7下游基因也会导致绒毡层发育和花粉外壁形成异常。p5126-ZmMs7转基因水稻和拟南芥也表现出相似的显性雄性不育性。同时，将mCherry基因与p5126-ZmMs7融合表达，有助于利用荧光选择实现在后代中对显性不育种子的分选。此外，ms7-6007隐性雄性不育系和p5126-ZmMs7M显性雄性不育系在不同遗传背景下均高度稳定，适用于玉米杂交育种。总之，我们的工作提供了深入了解花药和花粉发育的机制，并为作物杂交制种提供了一项有前景的技术。

关键词：ZmMs7；PHD finger；蛋白-蛋白互作；显性雄性不育系统

杂种优势是指杂合子子代优于纯合子双亲，在各种作物中增产20%至50%以上的现象。玉米是杂种优势利用最为成功的作物之一。人工或机械脱粒已广泛应用于玉米杂交种生产。然而，脱销不仅耗时、劳动密集、价格昂贵，而且不利于植株生长，从而降低玉米杂交种的产量。因此，雄性不育系是玉米杂交种商业化生产的关键。

雄性不育主要包括三种类型，即线粒体和核基因共同引起的细胞质雄性不育(CMS)、核基因单独引起的基因雄性不育(GMS)和光周期和温度敏感的基因雄性不育。基于CMS的三系系统已经成功地用于许多作物的杂交制种。例如，自20世纪80年代末以来，CMS杂交水稻已占中国水稻种植总面积的40%。然而，CMS系统已经遭受了几个内在问题，例如恢复系的遗传资源有限，水稻不育系和恢复系之间的遗传多样性较低，玉米不育系的病感性可能增加，且恢复不可靠。自20世纪90年代以来，基于光周期和/或温度敏感的基因雄性不育双系系统已初步应用于中国杂交水稻生产。它消除了雄性不育母系杂交的需要，几乎任何配合力好的可育系都可以作为父本，从而提高遗传资源的利用效率，进一步提高杂交水稻的产量。然而，使用这种系统产生的杂交种子的纯度可能受到不期望的气候或环境条件的影响。

雄性配子的发育是一个精心安排的过程;任何干扰都可能导致雄性不育。到目前为止，在植物中已经鉴定出100多个GMS基因，通过使用这些GMS基因及其相应的突变体来维持和繁殖GMS系作为母本用于杂交制种，已经在以生物技术为基础的雄性不育系统上做出了大量的努力。例如，杜邦先锋公司开发了一种叫做种子生产技术(SPT)的系统，利用玉米雄性不育基因45 (ZmMs45)，结合alpha;-淀粉酶基因和红色荧光基因DsRed来生产隐性GMS株系。最近，我们更新了SPT体系，并利用玉米GMS基因ZmMs7、ZmMs30和ZmMs33开发了多对照不育(MCS)体系。在水稻上也建立了类似的系统。此外，利用玉米显性GMS基因ms44建立了显性雄性不育系。尽管这些以生物技术为基础的雄性不育系统有几个优点，但它们依赖于克隆的GMS基因及其相应突变体的组合。因此，开发雄性不育系统对各种植物的杂交制种，特别是对没有克隆GMS基因的植物，将是一个有价值的应用。

ZmMs7编码一个PHD-finger转录因子(TF)，是玉米减数分裂后花药发育的关键调控因子。它的同源性已经在一些植物物种中被鉴定，如拟南芥雄性不育1 (AtMS1)，水稻雄性不育1/持久性绒毡层细胞1 (OsMs1/OsPTC1)和大麦雄性不育1 (HvMs1)。AtMs1和OsMs1/ OsPTC1突变导致绒毡层程序性细胞死亡(PCD)异常和花粉外壁形成缺陷。AtMs1和OsMs1/OsPTC1都是转录激活因子，OsMs1/OsPTC1与绒毡层调控因子如OsMADS15和TDR相互作用蛋白2 (TIP2)相互作用，调控绒毡层细胞PCD和花粉外壁形成。HvMs1和OsPTC1都能在功能上弥补拟南芥ms1突变，挽救雄性不育，表明AtMs1同源基因在高等植物中的功能可能是保守的。然而，AtMs1同源基因转录调控的确切分子机制仍然很大程度上未知。

在本研究中，我们研究了ZmMs7调控花药和花粉发育的分子机制，发现ZmMs7与玉米NF-Y亚基相互作用，形成多蛋白复合物，直接激活靶基因。在p5126的驱动下，ZmMs7的提前表达通过显著改变花药和花粉发育的基因表达网络，导致显性和完全雄性不育。利用p5126-ZmMs7转基因元件，我们构建了一个显性雄性不育(DMS)系统，该系统已被证明在玉米、水稻和拟南芥中有效。

1.结果

1.1 ZmMs7是绒毡层发育和花粉外壁形成所必需的

在我们实验室用功能互补技术克隆并验证了ZmMs7。为了进一步证实其控制雄性不育的功能，我们通过CRISPR-Cas9体系生成了4个ZmMs7敲除系。与野生型相比,所有的Cas9-ZmMs7敲除体系完全雄性不育，且没有外露的花药，并且在成熟阶段枯萎花药没有花粉粒，类似于ms7 - 6007突变体(图1A及SI附录，图S1)，表明ZmMs7玉米具有雄性生育能力。

图1:利用CRISPR-Cas9方法对WT、ms7-6007突变体和ZmMs7敲除株进行表型和细胞学比较。(A) WT、ms7-6007突变体和Cas9-ZmMs7-01系的雄穗(A1)、花药(A2)和I2-KI (A3)染色的花粉粒比较。(比例尺，A2为1mm, A3为200 mu;m).(B)野生型(B1 ~ B3)和ms7-6007突变体(B4 ~ B6)花药发育9 ~ 11期的横切面分析。(比例尺，50 mu;m).(C) WT (C1 ~ C3)和ms7-6007 (C4 ~ C6)突变体花粉粒发育的SEM分析。(比例尺，20 mu;m).(D) WT (D1 ~ D3)和ms7-6007突变体(D4 ~ D6) Ubisch体透射电镜分析。(比例尺，0.5 mu;m).(E) WT (E1 ~ E3)和ms7-6007 (E4 ~ E6)突变体花粉外壁TEM分析(比例尺，0.5 mu;m)。Ba,阴茎骨;CMsp,倒塌的小孢子;E,表皮;En,内层;F,基层;LD,脂滴;ML,中间层;Msp,小孢子;Ta,绒毛层;Tds,四联球菌;Te,致密层;Ub,乌氏体。

玉米花药发育可分为14个阶段。描述ms7 - 6007花药的细胞学缺陷,我们进行了扫描电镜、横剖面、透射电子显微镜分析,发现直到阶段9(图1B-D及SI附录，图S2-S4)，花药和小孢子发育进展与处于野生型和ms7 - 6007之间类似。扫描电镜分析表明，直到第10阶段野生型花药外表面有横条覆盖，第11阶段形成三维编织角质层，第13阶段完全生长。ms7-6007花药在第10阶段出现3D编织角质层，之后逐渐减少。在内表面，乌氏体在第9阶段出现在野生型和ms7-6007的花药中，随后在野生型中增大，在ms7-6007中逐渐消失(SI附录，图S2)。横断面分析表明，野生型和ms7-6007花药的发育差异发生在第9阶段之后。例如，在第11阶段，小孢子中的液泡消失，野生型花药中的绒毡层细胞几乎完全退化，而突变子房开始缩小，小孢子破裂(图1B及SI附录，图S3)。同样，对花粉的扫描电镜观察显示，野生型和ms7-6007的花药在第7- 9阶段相继产生了小孢子母细胞、成对、四分体和小孢子。第10阶段液泡化小孢子形成后，逐渐积累淀粉粒，第13阶段野生型花药室形成规则的圆形成熟花粉粒。相比之下，ms7-6007液泡化的小孢子在第10阶段严重下沉，在第12阶段消失(图1C及SI附录，图S3)。透射电镜观察表明，第9阶段野生型和突变型花药内表面均出现了乌氏体，在第9阶段后野生型中乌氏体逐渐增大，而在ms7-6007中乌氏体没有增大。野生型小孢子在第9阶段被明显的外壁包裹，在第10 - 13期形成了独特的层(顶盖层、杆状体层和足部层)并逐渐变厚。然而，ms7-6007的外壁比野生型薄得多(图1D、E及SI附录，图S4)。综上所述，ZmMs7功能缺失导致绒毡层退化延迟，乌氏体发育异常，花粉壁形成异常，这些发育缺陷最终导致雄性完全不育。

1.2 ZmMs7作为转录激活因子，调控参与绒毡层发育和花粉外壁形成的基因

采用实时荧光定量PCR检测ZmMs7在不同组织中的时空表达模式。ZmMs7转录本仅在8b - 10期野生型花药中检测到，在第9阶段达到高峰，说明在玉米花药中ZmMs7在四分体和游离单倍体小孢子期特异性表达(图2A)。ZmMs7编码一个定位于细胞核的PHD指形蛋白，支持其作为转录因子的功能(图2B)。在玉米原生质体中进行的瞬时双荧光素酶报告基因检测显示，ZmMs7显著增强了报告基因的表达，表明ZmMs7具有转录激活活性(图2C)。为了进一步测试ZmMs7在植物中的转录活性，我们将其与保守的抑制基

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