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嗜热光合绿丝菌绿小体中B798捕光基板的分离和表征分析

作者： Gabriel A. Montao,^sect; Hsing-Mei Wu, Su Lin, Daniel C. Brune, and Robert E. Blankenship*

单位：Department of Chemistry amp; Biochemistry, Center for the Study of Early Events in Photosynthesis, and Graduate Program in Molecular and Cellular Biology, Arizona State University, Tempe, Arizona 85287-1604

摘要：

本文主要介绍嗜热丝状厌氧光合细菌绿小体中的B798捕光基板的分离并进行表征分析。通过使用己醇洗涤剂处理冻融的绿小体进行分离。分离的基板由细菌叶绿素a、beta;-胡萝卜素和5.7kDa的CsmA蛋白组成，其组成比例为1.0的CsmA蛋白/1.6的细菌叶绿素a/4.2beta;-胡萝卜素。基板在798nm处有特征吸收光谱，类胡萝卜素的最大吸光度在519、489和462nm。通过稳态和超快时间分辨荧光以及吸收光谱测定，从类胡萝卜素到Bchl a的能量转移效率为30%。细菌叶绿素a吸收区域内的能量平衡表现出超快的动力学。圆二色光谱显示，没有证据证明在798nm区域内存在激子耦合的细菌叶绿素a池。

1 引言

绿色光合细菌是一种厌氧的光合细菌，含有一个被称为绿小体的天线结构^[1,2]。绿小体将能量转移到光合反应中心。绿硫细菌和丝状厌氧光合(FAP)¹细菌含有结构相似的绿小体结构^[3]；但是，绿小体的色素含量和整体组成取决于物种^[1]。绿硫细菌的绿小体附着在一种FMO天线蛋白上，这种蛋白作为能量转移的中介，将光能转移到光合反应中心。丝状厌氧光合细菌FAP缺乏FMO复合物，所以绿小体直接附着在完整的膜光合复合物上^[1]。嗜热光合绿丝菌(150times;50times;10nm)的绿小体位于膜的细胞质侧，能有效吸收光能，并通过B808866内周天线复合物将其输送到反应中心^[1,4,5]。

绿小体是一种特殊的天线复合体，因为它含有非常高的色素-蛋白质的比例，并被认为主要依赖于色素-色素的相互作用，而不是色素-蛋白质的相互作用^[1]。绿小体中含有大量的细菌叶绿素c,d,或e,类胡萝卜素和少量的Bchl a和蛋白质。这种复合物被一个主要由单半乳糖二甘油酯(MGDG)组成的单层膜所包围^[1,6,7]。

嗜热光合绿丝菌绿小体中的色素-色素聚集引起特征光谱射从670nm(单体Bchl c)转移到742nm(聚集Bchl c)^[1]。这些聚合体将自身组织成棒状结构，填充在绿小体的内部^[4,8]并且将能量传递到B798nm基板上^[6,7]，该基板成为能量从膜天线传递到反应中心的一种介质。这种基板被认为是一种色素-蛋白复合物，位于绿小体底部并将其连接到膜相关的色素-蛋白复合物上^[1,7]。电子显微镜显示了一个6nm周期性的晶体结构，该结构产生了绿小体与膜的附着位点^[4]。这可能是由于所谓的B798nm基板复合物，尽管这尚未被证明。

绿小体蛋白的位置和功能仍存在争议。纯化的嗜热光合绿丝菌绿小体中含有三种主要蛋白成分分别是CsmA, CsmM和CsmNs,其分子质量分别为5.7,11和18kDa,以及质量为5.8kDa的次要成分^[1,7]。这三种蛋白质已经通过金标电子显微镜技术定位到在脂质包膜^[9]；但是，它们的具体功能作用尚未确定。虽然CsmM和CsmN肽的部分是在脂质包膜区域观察到的，但是在基板可能存在蛋白的位置，使用抗体方法并没有确切的发现任何蛋白质位于绿小体的细胞质膜侧^[9]。

蛋白水解消化实验和CD光谱表明相关蛋白质参与和确定了整体的绿小体结构，特别是5.7kDa CsmA 蛋白质参与了Bchl c聚集体的组织。然而，现在认为5.7kDaCsmA蛋白不太可能是Bchl c结合蛋白^[9,14]。虽然蛋白酶K对绿小体的处理导致Bchl c吸光度的光谱变化，但尚不清楚这是由于5.7kDa蛋白的丢失，还是因为蛋白酶K有效地破坏了绿小体几乎所有的蛋白质含量。此外，5.7kDa蛋白的损失伴随着基板吸收的变化，包括Bchl a吸收^[11,13]的蓝移。

其他的研究已经表明，在嗜热光合绿丝菌的绿小体中类胡萝卜素合成抑制与CsmA蛋白水平相关^[15,16]。对绿硫细菌的绿小体也进行了类似的观察^[17]。此外，这些绿小体的吸收光谱只有各自的基板吸收区域产生变化^[17-18]。因此，类胡萝卜素的损失可能导致或与CsmA蛋白的损失相一致，并导致单体Bchl a在770nm处存在吸收光谱，因此观察到的基板光谱变化。

最近的证据表明，CsmA蛋白在绿硫菌中结合了Bchl a和类胡萝卜素^[18,19]。然而，尚未获得直接证据表明哪些蛋白质构成了嗜热光和绿丝菌中的绿小体基板及其色素组成。多年来，人们一直在研究基板的吸收能力与蛋白质浓度之间的相关性，但是，结果和解释不尽相同。Feick和Fuller（1984）提出了较小的5.8kDa肽作为Bchl的结合蛋白。其他研究小组反对这一解释，发现Bchl a 798nm的吸收与5.8kDa肽存在的数量之间没有相关性^[11,21]。

C. Aurantiacus 还含有一种膜结合的 B808-866 捕光复合物，根据序列同源性，它与来自紫色光合细菌的LH1复合物有关^[22-24]。然而，由于Bchl a在红外上有两个明显的特征峰，该复合物在光谱上与紫色细菌LH2复合物更相似^[7]。

最近的证据表明，5.7kDa蛋白，现在被称为CsmA蛋白^[12]，是组成基板复合物蛋白。5.7kDa蛋白已被证明与基板吸收有关^[25]。此外，它的降解也与基板的降解有关^[11,13]。这些发现改变了先前公认的Csm A与Bchl c结合的观点。

我们对Sakuragi等人的程序进行了修改^[25]，成功分离了基板，并对其进行了生化和光谱表征分析。这种方法依赖于暴露在冷冻温度下，对分离的绿小体进行己醇处理和洗涤剂提取^[26,27]，破坏绿小体组织。我们得出结论，该基板由Bchl a,beta; -胡萝卜素和5.7kDa的CsmA蛋白组成。它含有大量的beta; -胡萝卜素，其在结构和功能上的作用可能是光收集或光保护。

2 实验过程

2.1 绿小体的制备和基板的分离。

如前所述^[28]，C.aurantiacus 菌株 J-10fl 在55℃的D培养基中进行光异养生长。描述^[28]。在生长3-4天后，以10000g离心10min收集细胞，并在-20°C条件下保存。细胞在-20°C下冷冻2个月后，742nm 绿小体Bchl c 棒状元素的稳定性降低，导致吸收光谱中出现大量的670nm Bchl c 单体。然后，对Gerola和Olson ^[20]和Zhu等人描述的方法进行改进，用来分离绿小体^[28]。简而言之，将C. aurantiacus 重悬在pH为7.4的2M NaSCN/10mM磷酸盐/10mM抗坏血酸缓冲液中，在20 000 psi的法压壶中均质并破碎。然后以12500g离心20分，将细胞膜和细胞碎片制成颗粒，并将上清液装载到5-40%蔗糖梯度上。蔗糖梯度在266000g下离心18h，从25%至30%蔗糖梯度之间的条带中收集绿小体。通过凝胶过滤色谱法在Sephacryl S300柱上进一步纯化绿小体，并在4℃下保存。

通过Sukaragi等人描述的方法进行改进，分离出绿小体基板^[25]。取4毫升根据670和740nm峰高的组合确定的总OD为15，将其添加到pH值为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中的32mL饱和己醇溶液中 。向溶液中添加24毫升20%胆酸（ddH2O），并将混合物在37℃下培养6小时。将溶液以266000g离心60min，收集颗粒。然后将收集的颗粒均质并以3000g离心。收集上清液，在pH为7.6的10mM磷酸盐中透析，获得大尺寸但是组成均一的聚集疏水蛋白复合物，用于基底板的表征研究。

2.2 稳态吸收和荧光光谱。

使用日本岛津公司UV-2501PC分光光度计（光谱带宽为2nm）获取吸收光谱。稳态荧光光谱由国际光子技术(PTI)荧光计和先进光子公司光电二极管探测器拍摄。在825nm处监测发射，获得激发光谱，在485nm处监测发射光谱。光谱带宽为4nm。

2.3 SDS - PAGE

根据Schagger 和 Von Jagow研究，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）。将5微克来自绿小体和基板样品中的蛋白质加到凝胶中，加入pH为6.8的2%-巯基乙醇/100mMTris/8%SDS/24%甘油/0.02%溴酚蓝离解缓冲液。 分别用16.5%、10%和4%的丙烯酰胺作为分离凝胶、间隔凝胶和堆积凝胶。电泳后，凝胶用考马斯蓝R-250染色。

2.4 质谱

对于质谱，通过在alpha; -氰基-4-羟基肉桂酸基质中稀释少量样品来制备样品。样品在Vestec Lasertech Research MALDI-TOF质谱仪上以正离子模式运行。

2.5 蛋白质测序

如上所述，在SDS - PAGE上运行基板样品，并使用pH 11.0 w/20%甲醇的10mM 3-（环己基氨基）-1-丙磺酸（CAPS）缓冲液将其转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。然后用考马斯蓝R-250 对PVDF膜进行染色。从膜上切下 CsmA 条带并使用 Porton 2090E 蛋白质测序仪 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) 进行测序。以与上述相同的方式直接从液体样品中获得序列，产生前四个氨基酸。

2.6 圆二色性

使用OD798nm为0.4的分离基板样品，进行圆二色性研究。使用狭缝宽度为300micro;m、灵敏度为20mdeg的Jasco 710 CD光谱仪扫描并平均四个光谱。

2.7 超快光谱

使用1毫升OD798~ 0.2的分离基板和分离绿小体样品，进行荧光寿命测量。荧光寿命是使用前面描述的单光子计数装置使用荧光显微镜测量的^[30]。样品在605nm处直接激发进入基板或绿小体Bchl a的Qx吸收带，并在780和870nm之间检测到荧光发射。

飞秒瞬态吸收光谱是使用前面描述的泵-探针装置进行的^[31]。 样品在780和810nm处用100fs脉冲以1 kHz的重复频率激发。以2-nm波长分辨率记录740-910nm之间的吸光度变化。使用2mW的激光激发，偏振设置为相对于探测光束的魔角。对数据进行整体分析，以获得衰变相关光谱。

2.8 基板色素和蛋白质成分的测定。

为了确定色素比例，对样品进行等体积干燥，并将其溶解于甲醇（用于Bchl a）或己烷（用于beta; -胡萝卜素）中并获得吸收光谱。然后使用摩尔消光系数用于计算色素的相对摩尔比。Bchl a使用76mM-1cm-1^[32]，beta; -胡萝卜素使用128mm-1cm-1^[33]。

对于蛋白质组成测定，将一定测量量的样品干燥，并将含有200micro;L 6 M HCl（含1%苯酚）的真空管置于105℃下进行气相水解24 h，并通过Hewlett-Packard Amino Quant氨基酸分析仪进行分析。 使用5micro;g干燥alpha; -乳清蛋白样品作为对照。在用邻苯二甲醛对初级氨基酸进行柱前衍生后，用9-芴基甲基氯甲酸盐对脯氨酸进行柱前衍生后，样品自动注入C-18 HPLC柱，在该柱上分离氨基酸。氨基酸通过其在柱上的保留时间进行鉴定，并在通过荧光检测器后根据其荧光峰下的面积进行定量。

3结果

使用乙醇洗涤剂处理冷冻解冻获得的C. aurantiacus，获得分离的绿小体基板。纯化分离的基板样品的吸收光谱显示，基板Bchl a在798nm 处有一个很大的峰值，在519,489和462nm 处的峰值表示存在大量类胡萝卜素（图1）。由于残留单体Bchl c，吸收光谱在670nm处

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