全氟类化合物全氟辛酸、全氟辛磺酸、全氟磺酸、全磺酸、全氟壬酸对人类HepG2细胞潜在的遗传毒性影响研究外文翻译资料

全氟类化合物全氟辛酸、全氟辛磺酸、全氟磺酸、全磺酸、全氟壬酸对人类HepG2细胞潜在的遗传毒性影响研究

Kirsten Thorup Eriksen ^a,b , Ole Raaschou-Nielsen ^b , Mette Soslash;rensen ^b , Martin Roursgaard ^a , Steffen Loft ^a , Peter Moslash;ller ^a,

^a Department of Public Health, Section of Environmental Health, University of Copenhagen, Oslash;ster Farimagsgade 5A, DK-1014 Copenhagen K, Denmark ^b Institute of Cancer Epidemiology, Danish Cancer Society, Strandboulevarden 49, DK-2100 Copenhagen Oslash;, Denmark

摘要：合成的全氟类化合物（PFCs）因其具有抗湿性能和表面活性能而被广泛应用于工业产品中。PFCs被认为是致癌物而其可能的作用机制是氧化应激。我们之前的调查发现五种不同的PFCs有可能在HepG2细胞中产生ROS并引发DNA氧化损伤。虽然全氟辛酸(PFOA)和全氟辛磺酸(PFOS)分别使细胞内的ROS增加了1.52倍(95%CI,1.37-1.67)和1.25倍(95%CI,1.10–1.40),但ROS的增加并无浓度依赖性并且这两种化合物并不会导致DNA损伤；全氟磺酸(PFBS)和全磺酸(PFHxA)也不会使ROS增加或是引发DNA损伤；只有暴露在全氟壬酸（PFNA）下才会引起浓度水平的细胞毒性，DNA损伤适量增长，同时也能检测到乳酸脱氢酶被释放到细胞培养基中，但这与活性氧代并没有什么关系。这些结果表明，PFCs能在代表人类肝脏细胞的细胞系中可能会适当引起ROS的产生和DNA损伤。

关键词：单细胞凝胶电泳；ROS；DNA氧化损伤

1. 引言

全氟化合物(PFCs)是由氟氯化合物合成的，是一种典型的碳骨架化合物，通常为4-14个碳原子长度和一个带电荷的部分组成，主要是羧酸盐或磺酸盐。全氟辛酸（PFOA）和全氟辛磺酸（PFOS）是运用最广泛的两种PFCs。他们都是八碳骨架，PFCs因其抗湿性和表面活性而广泛应用于工业生产中^[12]。并且研究表明他们可以抗代谢，但同时具有生物持久性和生物累积性，这些已在野生动物^[3]和人身上^[4-7]得到验证。由于对新的PFCs的严格控制和公认的危害较小的PFCs的替换，最近几年环境中的PFOA和PFOS的释放量逐渐降低，但还是会在环境和人类血液中检测出不同碳链长度的PFCs，包括全氟磺酸（PFBS）、全磺酸(PFHxA)、全氟壬酸（PFNA）^[8]。例如，长期暴露于PFOA和PFOS的大鼠的肝脏、胰腺、睾丸中会随之出现肿瘤^[10-12]，而PFBS具有4-碳骨架，由于具有低毒性所以被用作PFOS的替代品^[9]。虽然对人类的研究很少，但是已有研究表明血浆中的PFOA和PFOS的水平并不会显著提升肝脏、前列腺、膀胱、胰腺患癌的风险^[13]。职业暴露研究表明前列腺癌与膀胱癌和暴露于PFOA、PFOS没有很大的关联性^[14-16]。PFCs被认为会引起大鼠和小鼠患肝癌，可能是因为活化过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）会导致过氧化物酶体增殖^[17]。而PFCs的特征与过氧化酶增殖体的特征被认为是相似的，因而PFCs被认为是非遗传毒性物质。虽然这还存在争议，但大鼠与小鼠体内的PPAR激活与氧化应激有关，包括DNA的氧化损伤导致过氧化物酶体增殖物导致肿瘤的发生。然而这种作用方式具有高度特异性，对人类的影响较小^[18]。一些研究表明用艾姆斯氏试验法可以进行关于遗传毒性的一系列经典的综合性测验并且已经证明染色体结构的损伤并不会引起点突变或是染色体结构畸变。但是还是有一些证据表明，PFOA和PFOS会导致氧化应激作用和DNA损伤^{[10,12,19–25]}.。

本研究的目的是探讨其产生的ROS的能力，以及诱导人HepG2肝癌细胞发生DNA氧化损伤的程度。但因为存在种间差异，所以从大鼠或小鼠细胞的研究结果进行推断还是须持怀疑态度，特别是有关PPAR的活化。研究表明，HepG2细胞暴露在PFOA中，细胞内、PPAR的增加与相关基因的表达，包括酰基辅酶A氧化酶无关^[26]。在我们的研究中，HepG2细胞被暴露于三种新类型的鲜有研究的PFCs（PFOS，PFOA和PFHxA）以及被研究很多的两种PFCs（PFOA和PFOS）中，试图解决潜在的构效关系。我们使用了肝细胞衍生的细胞系，因为肝脏是目标组织并且在之前对PFCs的研究中已使用过HepG2细胞^{[10,21,22,24]}。用荧光素作为荧光剂来测定ROS的生成。DNA损伤通过彗星试验测定DNA链断裂（SB）和氧化损伤嘌呤在甲酰胺基嘧啶－DNA糖苷酶（FPG）的敏感位点。

2.材料和方法

2.1.化合物

全氟辛酸（PFOA;CAS号：335-67-1），全氟辛烷磺酸（PFOS;CAS号：1763-23-1），全氟磺酸（PFBS;CAS号：375-73-5）全氟壬酸（PFNA;CAS号：375-95-1）和全氟己酸（PFHxA;CAS号：307-24-4）购自Sigma公司。

2.2. 细胞培养

从美国典型培养物保藏中心（马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国），获得人肝癌HepG2细胞系。将细胞在Eagle有10%胎牛血清，1%L-谷氨酰胺和1％卡那霉素/链霉素的必需培养基中培养，放在37℃，5%CO₂的环境中。

2.3. 活性氧（ROS）的与二氯二氢荧光素检测

Jacobsen等人测定细胞内产生的ROS是将五万个HepG2细胞用DCFH-DA（10mu;M）孵育15分钟，用Hanks缓冲盐水溶液洗涤两次，并暴露于浓度范围为0.4M-2mM的PFC中，接种到96孔不透明培养平板并培养过夜，最后使用2，7-二氯荧光素测定二乙酸酯（DCFH-DA）（Invitrogen）来进行染色^[27]。我们使用了很大的浓度范围，因为据我们所知，ROS的生成量先前并没有被研究过。全氟化合物溶解于二甲基亚砜（DMSO），并进一步稀释于培养基中（2.2节）。细胞溶液中DMSO的浓度至多为0.2%。未经处理的细胞用作对照与接受DMSO处理的相同浓度的细胞溶液一起培养。我们在HepG2细胞（100，500和1000M）中加入氧化氢作为对照。暴露后，立即用荧光分光光度计在激发光线485纳米和发射光线538nm检测，可以检测出ROS的产生。ROS实验进行三天，每天暴露三份样品，这意味着每天需要测量三份样品进行统计分析(N=3)。实验中，日间的变异为28%，未曝光控制的总变异的72%。

2.4．通过彗星试验测定DNA损伤

如前所述，检测链断裂形成的DNA损伤（SB，包括碱不稳定位点）和甲酰胺基嘧啶－DNA糖苷酶（FPG）敏感位点的DNA通过使用彗星测定法^[28]。简言之，将2.25times;10⁵HepG2细胞接种到24孔培养板中并孵育过夜，以确保适当的环境条件。孵育细胞的PFC的浓度为100M和400M。我们选择这些浓度，因为先前的研究已在SB（彗星试验）和氧化性DNA损伤的测定中表现出浓度依赖效应，而测量8-oxo-7,8-dihydro-2-脱氧鸟苷（8-oxodG）基于抗体的免疫组织化学方法^[25]。暴露于PFC24小时后，将细胞胰蛋白酶化并以3000rpm离心5分钟。细胞被嵌入到0.75%的琼脂糖凝胶并在裂解液（92.5M氯化钠，100mM的NA2EDTA，10mM的三羟甲基氨基甲烷碱，pH值=10.0）中过夜裂解。凝胶在缓冲液中洗涤3次，每次5分钟（40mMHEPES缓冲，0.1M氯化钾，0.5mM Na2 EDTA，200克/毫升BSA，pH=8）。FPG酶加入到凝胶，并在37℃孵育45分钟。FPG酶是由安德鲁·柯林斯博士（奥斯陆大学，挪威）发现的。然后凝胶转移到碱性溶液（1mM Na2 EDTA，300mM的氢氧化钠，pH值gt;13.0）中40分钟，随后在300mA的相同的缓冲液和0.83伏/厘米电泳20分钟（从阳极到阴极）。电泳后，凝胶在中和缓冲液（0.4M的Trizma碱，pH值7.5）洗涤3次，每次5分钟，用水冲洗并浸入96％乙醇过夜。

1. 结果

3.1. ROS生成量

图1为五个的PFCs浓度产生ROS的趋势.我们发现PFOA和PFOS使ROS显著增加，分别使ROS增加了1.52倍（95％CI，1.37-1.67）和1.25倍（95％CI，1.10-1.40）。PFOA与其他全氟化合物（plt;0.05，事后LSD）相比能产生更多的ROS，其中PFNA，PFBS和PFHxS稍微不明显，除了PFNA在1或2mM、PFHxA在0.4-200M。我们观察到暴露于PFCs的细胞中ROS没有任何的明显的浓度-效应关系，而暴露于过氧化氢的细胞中ROS的产生具有浓度依赖性。

图1 HepG2细胞暴露在浓度范围为0.4–2000M的五种全氟化合物中和暴露在过氧化氢(100,500and1000M)三小时后ROS的产生量（与未曝光的细胞相比成倍增长）。每个竖条代表三种独立实验的平均值和标准误差。未暴露的HepG2细胞的平均值和标准误差为20.0plusmn;2.3。*代表与未暴露的细胞相比化合物对细胞的影响十分显著(plt;0.05,post hoc LSD)。^#表示过氧化氢对细胞的影响十分显著(plt;0.05,post hoc LSD)。

3.2. SB和FPG敏感位点测定说明DNA发生损伤

图2描绘了HepG2细胞暴露在PFC100M和400M后SB和FPG-敏感位点之间的关系。暴露于PFNA的SB水平显著增加了1.6倍（95%CI，1.09-2.12）。我们没有发现任何能显著增加FPG敏感位点的PFC，无论是在100M还是在400M。除了暴露在最高浓度的PFOS和PFOA中细胞内LDH释放量为43%和66%以外，暴露在其他PFC中LDH释放量为5%或更低（结果未显示）。

图2 HepG2细胞暴露于浓度为100M和400M的五种全氟化合物24小时后SB和FPG敏感位点的情况。每个竖条代表三种独立实验的平均值和标准误差。细胞暴露于Ro19-8022和白光(N=5)代表阳性对照。*表示与未暴露于化合物的细胞相比SB水平变化显著。

4. 讨论

在本文中我们已经证明，暴露于PFOA和PFOS的肝癌细胞使ROS分别增加1.52倍和1.25倍。全氟化碳并没有引起的DNA氧化损伤，而暴露于PFNA则会使SB的水平增加1.6倍并与细胞毒性水平升高相关。所以我们的数据并不能说明PFCs产生的氧化应激反应和DNA损伤之间存在潜在的相关性。

先前的碱性彗星试验研究显示，暴露于PFOA1小时的肝癌细胞的SB的水平呈浓度依赖性增加[24]。因为彗星试验条件不同，所以孵化时间和我们的调查不同。Yao和Zhong通过DCFH-DA分析，还测出ROS的产生会在3小时后增加4倍。我们的研究和其他研究中肝癌细胞由于PFOA而产生ROS的结论是一致的^[21,25]。然而，这些数据显然是与我们的研究，这只表明适度的影响，并没有增加的浓度依赖性。也有研究表明PFOA引起浓度依赖性的方法可在抗体检测中应用^[24]。这些数据也是在我们的FPG敏感部位的评估结果;它应该在这方面强调的是，包括在我们的测定中，暴露于Ro19-8022光敏剂并用白色光照射的细胞FPG-敏感位点水平升高。Griffiths等研究报告指出，对照组中8-oxodG的水平为0.126ng/g^[10]对应于730lesions/10⁶dG，8-oxodG的分子量为283.2，故1fmol/g DNA相当于1.64lesions/10⁶dG^[36]。在我们的研究中FPG-敏感位点水平相当于0.37lesions/10⁶dG（标准差=0.22lesions/10⁶dG）。

我们研究的目的是探讨不同的碳骨架的PFCs造成氧化应激的潜能，包括碳四、碳六（PFBS）（PFHxA）、碳八（PFOA和PFOS）和碳九（PFNA）PFCs，为了解决结构–活性关系。我们发现的有意义的结果为八和九个碳链长度的PFCs。在对动物的急性毒性研究中表明最长的全氟化碳骨架长度的PFCs也是最具毒性的，全氟化碳的长度和毒性之间的关系可以由动力学参数的解释，因为它已被证明，消除率最高的是具有短碳长度的PCF^[41,42]。

本文研究了PFCs的单一暴露，这可以看作是一个限制，因为大量的PFCs可以与其他危险化学品相互作用产生毒

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