蚕沙粪便中提取的抗病毒物质： 其抗病毒活性的特征外文翻译资料

蚕沙粪便中提取的抗病毒物质：

其抗病毒活性的特征

摘要：从蚕粪便中纯化的抗病毒活性物质在HVJ-LLC-MK2细胞系统被检验。其抗病毒效果取决于光照时间，并且受亚硫酸钠和厌氧条件的抑制。这些结果表明L4-1的抗病毒活性与活性氧产生的物质有关。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，这种物质在光照下，能损伤病毒蛋白。结果表明，其抗病毒活性是由于通过L4-1产生的活性氧来引起病毒蛋白的损伤。

关键词：抗病毒活性；叶绿素衍生物；活性氧； 光照

对于细胞功能的研究，我们一直在寻找某种具生物活性的物质。在研究过程中，一种命名为L4-1的抗病毒物质，是从蚕的粪便中分离的。它是一种类似于叶绿体的物质，分子量约为530。它能在包膜病毒上标记抗病毒活性，如HVJ（仙台病毒），HSV（单纯疱疹病毒1型），和HIV（人类免疫缺陷病毒1型），但不能标记在非包膜病毒。L4-1能直接影响病毒粒子本身，并且抑制由病毒聚合酶控制的病毒特异性基因组的合成，而不会影响HVJ-LLC-MK2细胞系统的吸附或病毒进入宿主细胞。L4-1在光照条件下也显示出溶血活性，但它的抗病毒活性没有出现在黑暗中，也不存在于血清。然而，L4-1的抗病毒活性的机制在分子水平上还不是很清楚。

据报道，在可见光下叶绿素衍生物显示出抗病毒活性。然而，其抗病毒作用的机制仍不明确。L4-1是已知的叶绿素衍生物中抗病毒活性潜力最强的。因此，在本研究中，我们研究了L4-1的活性机制，特别是其与活性氧的关系。

材料与方法

细胞和病毒。将从猴肾中提取出来的LLC-MK2细胞，放在如前所述的添加有10％小牛血清的最低限度基本培养基中生长。

将日本血凝病毒的Z株型放在如前所述的含胚鸡蛋中繁殖，并将感染性尿囊液收集并保存于4℃直到使用前。

抗病毒活性物质。如先前所描述的抗病毒物L4-1是从蚕粪便提取物中纯化得到的。将焦脱镁叶绿酸a和血卟啉二盐酸盐溶解于1mg/ml二甲基亚砜, 暗处理保存在零下20℃的氮气中直到使用前。将吖啶橙和曙红Y溶解在磷酸缓冲盐溶液（PBS( - )：NaCl 8 g/L, KCl 0.2g/L, Na₂HPO₄.12H₂O 2.9 g/L, KH₂PO₄ 0.2 g/L），并于4℃下保存。

抗病毒物质的病毒感染和治疗。如上所述，HVJ感染LLC-MK2细胞。简而言之，HVJ接种到LLC-MK2单层细胞上，通过多重感染，将其培养在Dulbecco改良的含10%CS的Eagle培养基中。在感染24、48小时后，用Salk的模式方法测定血凝活性作为病毒产量的指标。

HVJ经如前所述的抗病毒物质的处理后感染。即0.1毫升的HVJ悬浮液混合0.1毫升L4-1、焦脱镁叶绿酸a、血卟啉、吖啶橙或曙红Y，并在冰浴15 min后感染。

在如前所述的光照射实验中进行。

厌氧条件下处理0.3毫升的HVJ和0.3毫升的L4-1，将其分别通入氮气约10分钟，然后混合在一个密封的小瓶中，在氮气下冰浴下15分钟。

活性氧的检测。用肾上腺素氧化法。简而言之，在光照下，取1毫升1mM的肾上腺素混合于含1mM的乙二胺四乙酸和200ng/mL的L4-1的PBS上，将其放在冰中。用分光光度计在480纳米波长下测量溶液的吸光值。

用活性氧清除剂预处理L4-1。用0.05毫升的硫酸钠、alpha;-生育酚、组氨酸、beta;-胡萝卜素、甘露醇或山梨醇在冰浴条件下预处理0.05毫升的l4-1样品，或用0.05 毫升的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶在室温下处理15分钟后用HVJ处理。

病毒蛋白的制备。将纯化的HVJ悬浮液与0.2毫升的L4-1、焦脱镁叶绿酸a、血卟啉和吖啶橙或曙红Y在光照条件下冰浴15 min。该病毒通过超速离心法收集，而病毒蛋白于0.5%的十二烷基硫酸钠在黑暗条件下室温处理60分钟后提取。用Lowry等人的方法来确定病毒蛋白的浓度。

电泳和免疫印迹法。如Laemmli阐述的进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。在0.05M的二硫苏糖醇的存在下，HVJ结构蛋白减少或不减少（未煮沸3分钟），并在20mA的恒定电流下，于10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离。通过奥克利等人阐述的考马斯亮蓝R250或银染色法来检测病毒蛋白。

进行如前所述的免疫印迹法。兔抗血清HVJ为第一抗体。用高速扫描器CS-9000采用双波长法测定病毒谱带强度。

结果

L4-1抗病毒活性的光照要求

据先前报道，从蚕沙中分离得到的在光照条件下显示出抗病毒作用但在黑暗条件下不显示。为了阐明L4-1的抗病毒机制，经仔细检查，其作用于HVJ-LLC-MK2细胞系统中运行。

首先，我们测试L4-1的抗病毒活性是否依赖于光照时间。为此，将HVJ用经不同光照时长的L4-1处理后感染。如图2a所示，在光照1分钟后，HA病毒产量随时间下降，且几乎完全被抑制。据报道，在这个时候没有观察到L4-1对于LLC-MK2细胞的细胞毒性。结果表明，L4-1的抗病毒作用依赖于光。

当只将L4-1预光照，然后在黑暗中添加到HVJ中，未见其抗病毒活性。这一结果表明，L4-1只在光照条件下是有效的。

光照条件下来自于L4-1的活性氧的产量

卟啉和叶绿素在可见光中产生活性氧。此外，已知活性氧能损伤蛋白质、核酸和脂质。L4-1是一种叶绿素衍生物，且其仅在光照条件下显示出明显的抗病毒作用。这些研究结果表明，在光照条件下L4-1产生活性氧，并显示出抗病毒活性。所以，来自于L4-1的活性氧的产量是由肾上腺素氧化法来确定的，这是一般用于活性氧的检测方法。用这种方法，肾上腺素被活性氧氧化，而在480nm吸光度下检测到肾上腺素红形成。如图3所示，在光照条件下，存于L4-1的肾上腺素红的产量增加具时间依赖性，而在黑暗中没有检测到其产生。这些结果表明，l4-1只在光照条件下产生活性氧。

亚硫酸钠对L4-1抗病毒活性的影响

以上结果表明，L4-1的抗病毒活性与活性氧的产量相关。对L4-1的抗病毒活性及其产生活性氧的能力之间的相关性，采用如亚硫酸盐等各种活性氧清除剂被证实。如图4A所示，用200mM的亚硫酸钠预处理L4-1，病毒的产量完全恢复。然而，其抗病毒活性不受其他物质影响，如alpha;-生育酚、组氨酸、beta;-胡萝卜素，甘露醇、山梨醇、过氧化氢酶或超氧化物歧化酶。为了确认活性氧的作用，我们在存有氮气、厌氧条件下检测了L4-1的抗病毒作用。在氮气中预处理L4-1 HVJ，即使在光照条件下也没有检测到其抗病毒活性。从这些结果可以得出的结论是，L4-1的抗病毒活性是由于L4-1产生的活性氧。

我们证实，其他物质产生的活性氧具有抗病毒作用。叶绿素衍生物、焦脱镁叶绿酸a和血卟啉也能抑制病毒的产生，但具可剂量依赖性，分别在8和40mu;g/mL病毒得到完全抑制。然而，L4-1在较低浓度下比较活跃。吖啶橙与曙红Y，这些都不是卟啉类化合物，在光照条件下产生活性氧。它们的抗病毒效果在光照条件下也能检测到。

L4-1对于病毒蛋白的影响

如果来自于L4-1的活性氧能破坏病毒，有些改变可能在病毒成分中观察到。因此，对病毒蛋白进行电泳分析检测。在光照条件下，用L4-1处理HVJ病毒，发现病毒蛋白条带几乎完全消失，而暗处理下，检测到病毒带与控制时相同。

当病毒蛋白质进行银染时，具有比考马斯亮蓝染色更高的灵敏度，即使是在光照条件下L4-1处理的样品中，也能检测到病毒带。虽然病毒蛋白的模式具明显的不同，但经相对强度的染色都减少了，相比于那些经一定时间未处理或暗处理获得的病毒。值得注意的是，聚合酶和血凝素神经氨酸酶蛋白的强度都广泛下降。通过免疫印迹法在抗HVJ多克隆抗体也得到了相同的结果。此外，在光照条件下病毒蛋白谱带的强度下降具时间依赖性。P-蛋白对损伤更敏感。这些结果表明，在光照条件下，来自于L4-1的活性氧造成病毒蛋白的损伤。如前所述，L 4-1的抗病毒活性能被小牛血清灭活。用存于CS的L4-1预处理病毒，未检测到损伤的HVJ蛋白条带。

我们也对由其他物质产生的活性氧对病毒蛋白的影响进行了检测。在处理过的焦脱镁叶绿酸a中，得到了一个类似于L4-1情况的电泳模式：在考马斯亮蓝染色处理下的病毒蛋白条带几乎完全消失，在银染处理下的P-蛋白和HANA-蛋白的强度均明显降低。在血卟啉，一种属于卟啉类化合物以及焦脱镁叶绿酸a的控制下，病毒带染色减弱，且迁移率比对照略有不同。此外，没有检测到P-蛋白。吖啶橙和曙红Y对病毒蛋白的电泳图谱都未起作用，虽然这两个都抑制病毒产生。

我们还研究了是否HVJ的脂质或核酸受L4-1的影响。据报道，从它的化学特性上看，L4-1似乎是焦脱镁叶绿酸a的一种衍生物。那么，是否 HVJ是经焦脱镁叶绿酸a处理得到的而不是L4-1，并且HVJ的膜脂和RNA是由Bligh 和Dyer的方法获取的，或者由异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取的。将脂类和核酸分别用薄层色谱法、琼脂糖凝胶电泳法处理，观察到脂质组分没有显著改变，病毒基因组也未被分解。

讨论

有报道说，活性氧能抑制包膜病毒的侵染。Lee和Lee报道，从蚕的粪便提取的叶绿素衍生物的混合物在光照条件下，能抑制离体的Gross白血病毒逆转录酶活性。然而，这些衍生物的抗病毒机制仍不清楚。L4-1不仅作用于逆转录酶病毒，也作用于DNA病毒，如HSV。此外，相比CpD-D，L4-1在较低浓度下能更有效地对抗这些病毒。因此，L4-1是带状疱疹的一种潜在药物可制成软膏。因此，我们对L4-1的抗病毒活性进行了详细的阐述。

L4-1的抗病毒活性依赖于光照，且其仅在光照条件下才产生活性氧。此外，它的活性在亚硫酸钠或厌氧条件下降，这些情况抑制了活性氧的产生。这些结果表明L4-1的抗病毒作用是由于其活性氧的产生。电泳分析结果表明，来自于L4-1的活性氧引起了病毒蛋白的改变。曾有一个报道，在电泳分析中可观察到活性氧引起的蛋白质的变化；其诱导电荷的改变，色氨酸的损失，且能导致蛋白质的聚集或碎裂。我们相信这样一个事实：L4-1能诱导病毒蛋白。在电泳分析中可观察到L4-1明显损伤了P-蛋白和HANA蛋白，而P-蛋白对损伤更敏感。我们已经证实，HANA蛋白的受体结合活性未被干扰，而病毒RNA的复制和转录均受L4-1的抑制。这表明P-蛋白的损伤是对HVJ抗病毒活性最有可能的解释，尽管不能排除对其他病毒蛋白，如膜蛋白的损伤。HVJ的RNA被核衣壳蛋白包裹。病毒的膜脂来源于宿主细胞膜，该膜含有如生育酚这样的活性氧清除剂。因此，可以想象的是，相比于病毒蛋白，病毒RNA和膜脂上未发生明显的改变。

我们并未用吖啶橙或曙红Y来检测病毒蛋白质的变化，尽管这些染料具有抗病毒活性。这是可能的—L4-1的抗病毒活性与超氧阴离子和羟基有关，因为亚硫酸钠会与O₂^-或bull;OH反应，抑制L4-1的活性，而吖啶橙与曙红Y对单线态氧的产生有关。据Davies报道，每一个活性氧对蛋白质都有不同的作用。因此，叶绿素类似物如L4-1或血卟啉等这些色素可能产生不同种类的活性氧，它们可能不会影响病毒蛋白质，但其他病毒成分如病毒核酸可能会受影响。关于这一点，许多活性氧清除剂经研究是无效的。虽然其中的原因还不清楚，但与清除剂的各种抑制机制可能相关。亚硫酸钠和厌氧条件下造成氧气的耗尽，活性氧的来源，而其他清除剂不影响氧含量，它们可作为抗氧化剂或活性氧的去除剂。

一般情况下，L4-1似乎只对包膜病毒有效。最近，我们认识到，L4-1也能灭活流感病毒，它是一种包膜病毒。这表明病毒包膜成分对于L4-1的抗病毒活性是必要的。活性氧据报道能生成有毒的烷基自由基和脂质的过氧自由基。此外，来自于脂质过氧化物的4-羟基壬烯醛能显著损伤基本的氨基酸、组氨酸或赖氨酸，并能使酶失活。经L4-1处理后，经酸性染料染色后，大多数的HVJ蛋白条带未被检测到。这一发现表明，组成HVJ蛋白的 一些基本的氨基酸改变了。因此，其对一个新的有毒物质的抗病毒作用的可能性仍然存在，这个新的有毒物质是由一些包膜病毒的脂质产生的，如4-羟基壬烯醛。

外文文献出处：Microbiol Immunol, 44(8), 669-676, 2000

(微生物免疫学杂志. 2000. 44(8):669-676)

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