电化学微反应器与质谱联用用于在线氧化和生物碱的实时检测外文翻译资料

电化学微反应器与质谱联用用于在线氧化和生物碱的实时检测

原文作者 Juan Yang College of Material Chemistry and Chemical Engineering, Hangzhou Normal University, Hangzhou, P. R. China

摘要：本研究的主要目的是使用在线电化学/四极杆飞行时间质谱系统研究生物碱的原型和氧化产物。在电化学反应池中模拟了氧化相Ⅰ和Ⅱ的代谢。在装有玻璃碳工作电极的薄层电池中，对黄连和麻疯草碱的代谢过程进行了模拟，同时使用掺硼金刚石工作电极模拟了小檗碱和巴马汀的代谢过程。使用新的实验系统，将不同的电势应用于电化学电池，检测了脱氢、脱甲基、甲基化、羟基化以及两个羟基化加合物的形成。与谷胱甘肽在线反应产生不同的共价谷胱甘肽加合物。从电化学模拟获得的结果发现与先前体内报道的结果非常一致，表明电化学/质谱是研究各种复杂组分的代谢反应的有效工具。此外，通过液相色谱-质谱联用分析肝微粒体中的生物碱，证实了使用电化学技术模拟目标化合物代谢的可能性。

关键词： 生物碱； 黄连； 电化学； 肝微粒体； 飞行时间串联质谱

1介绍

电化学（EC）作为氧化还原反应的经典方法，已被认为是研究复杂组分中潜在氧化代谢物的有价值的筛选工具^[1]。电化学转化用于药物及其代谢产物的靶向合成，以表征代谢产物的结构并预测代谢途径，具有巨大的潜力和发展方向。该领域的研究表明，尽管酶促反应的机理与电化学氧化反应不同，但使用电化学系统联用质谱能够模拟典型的Ⅰ相途径^[2,3]。与常规体外培养（例如肝微粒体）相比，EC技术可用于检测代谢研究中的代谢物。在2019年，Szultka-Mlynska等人将电化学反应与肝细胞色素P450（CYP）催化的代谢反应进行了比较，发现EC系统特别适合模拟各种免疫抑制剂的脱烷基、甲基化、羟基化和乙酰化反应^[4]。EC技术在代谢研究中的实用性已被证明可用于许多常用药物，例如阿莫地喹^[5]，心血管药物^[6]，抗菌药和抗真菌药^[7]。利用EC来模拟代谢产物不需要昂贵的酶或辅因子，但是此过程的选择性低，并且仅是体内途径的近似值。在大多数情况下，已通过将EC仪器与ESIMS耦合来鉴定目标分析物的潜在代谢产物^[8]。此外，由于EC-LC-MS样品消耗少，灵敏度高，分析速度快等优点，已成为一种高效、可靠的代谢物分析方法。然而，EC联合MS在天然产品中具有药用特性目标化合物的应用上值得探索。

肝微粒体已广泛用于体内药物代谢测试，可用于预测潜在的代谢产物，提出代谢途径，并为进一步的药物靶向研究提供重要指导^[9]。CYP是一个庞大而多样的酶类，可催化众多的氧化反应，CYP是参与复杂药物代谢和生物活动的主要酶，约占所有代谢反应的75％^[10,11]。药物代谢反应可分为两类：阶段Ⅰ和阶段Ⅱ。CYP在阶段Ⅰ代谢和异源生物的药代动力学中起重要作用。在阶段Ⅰ中观察到的有意义的过程包括水解、氧化和还原^[12,13]。阶段Ⅱ主要针对一般的亲脂性化合物，并通过与内源性物质（如谷胱甘肽（GSH），葡萄糖醛酸和硫酸盐）结合而发生^[14]。评估目标分析物代谢的常规方法包括体内和体外培养肝细胞或微粒体，然后进行色谱分离和产物鉴定^[15]。但是，样品预处理过程经常会产生不确定性和误差，此外，对于需要大量消耗样品量的、复杂的样品的制备需要很长时间，并且必须重复多次。

黄连属于毛茛科，是最广泛使用的天然药物之一，由于其多种药理作用而备受关注。黄连用于减少胃痉挛，预防腹泻，减少发烧和心脏病的风险^[16]。此外，它在抗氧化，清除羟自由基和抗炎等领域引起广泛关注^[17,18]。五味子的最主要活性成分是生物碱，例如小檗碱（BBR），黄连碱（COP），盐酸药根碱（JAT）和巴马汀（PAL）。BBR是具有抗炎作用的生物碱，是黄连属植物的主要活性成分^[19]。最近的研究表明，BBR具有治疗糖尿病的潜力^[20,21]。COP是生物碱的另一主要成分，可抑制A型单胺氧化酶，抑制破骨细胞的分化和功能，保护胃粘膜等^[22]。Yokozawa等人报道说C.chinensis提取物及其生物碱可以改善与肾小管细胞ONOO（-）的产生所引起的相关的细胞损伤^[23]。传统的体内方法已用于研究生物碱在大鼠口服和静脉内给药后的药代动力学行为^[24]。因此，全面鉴定各种生物碱的代谢途径对于临床应用至关重要。

图1 在线CE结合Q-TOF / MS系统的示意图。在阶段Ⅰ和阶段Ⅱ氧化过程中，使用了配有工作电极的薄层电池

电化学细胞系统已用于研究选定生物碱的代谢途径，使研究人员能够模拟氧化电化学转化并阐明目标分析物的降解途径。这项研究阐明了在体内实验中发现的目标分析物的代谢转变可以通过纯仪器方法预测。

该方法由反应池与MS结合组成。在当前工作中，氧化过程是通过使用EC检测器来模拟的，该EC检测器由ROXY恒电位仪控制的薄层反应池组成。研究了生物碱在正离子模式下的电化学氧化反应，所得结果与体外培养的大鼠肝微粒体进行了比较。

2 材料和方法

2.1化学品和试剂

标准参考材料包括BBR、COP、JAT和PAL均购自成都必须生物技术公司（中国成都）。HPLC级甲酸铵购自北京华为瑞科化工（中国北京）。此外，25-28％的氨由Meryer化学技术公司（中国上海）提供。HPLC级beta;-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯（beta;-NADPH），乙腈和甲醇购自Sigma-Aldrich（上海）Trading（中国）。磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）和磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）购自AlfaAesar（中国）。化学品SD大鼠肝微粒体由上海肝病研究所（中国）提供。六水合氯化镁（MgCl₂）购自TCI发展公司（中国上海），GSH购自百灵威化学（中国上海）。高纯水（LC-MS级）购自Merck化工（中国上海）。

2.2仪器条件

2.2.1电化学

通过在线连接到高分辨率质谱仪的ROXYtrade;EC系统（Antec，Zoeterwoude，荷兰）进行了模拟代谢反应的电化学实验。该EC仪器配备了ROXY稳压器，电化学反应池（薄层ReactorCelltrade;）和双注射器输液泵。薄层反应池由三电极组成，包括参比电极（湿面积为14.34 mm²），工作电极和反电极。本实验中使用的工作电极为玻璃碳电极和掺硼金刚石电极。玻碳和硼掺杂金刚石工作电极的电势分别从100到3000 mV和从100到4000 mV线性增加。使用Antec对话软件实时记录由施加的电压引起的光谱变化。支持信息表S1和S2显示了施加电势随时间变化的趋势。所有分析均以恒定流速（10 micro;L/ min）和35 ℃的柱箱温度进行。图1显示了EC / MS管理的原理图。

2.2.2液相色谱系统

采用Agilent 1260系列UHPLC系统（美国安捷伦），配备有四联泵、恒温控制柱温箱、自动进样器和二极管阵列检测器的进行代谢物鉴定。色谱分析是使用RP色谱柱ZORBAXSB-C18（5 micro;m，4.6 mmtimes;150 mm，安捷伦），流动相组成为0.1％甲酸溶液（A）和甲醇（B）进行的。进样量为1 mL，在25 ℃时恒定流速为0.4 mL/ min，并提出了梯度洗脱程序：色谱程序被初始化为30％B，并在4 min时升高到50％B，在6 min时经历80％B 8min，梯度增加到85％，直到9 min，梯度增加到100％，然后转向初始条件为10分钟时30％B。

2.2.3质谱条件

一方面，使用安捷伦6545Q-TOF/ MS（安捷伦科技有限公司，美国圣克拉拉）和安捷伦1260 UHPLC分析用于微粒体温育的代谢物。另一方面，使用Q-TOF/ MS技术对电化学氧化还原产物进行连续注入测定。6545Q-TOF/ MS配备有安捷伦喷射蒸汽电喷雾（AJS）技术，在阳离子模式下进行全扫描。Dual AJS ESI使用以下参数：气体温度为350 ℃；干燥气体速率为12.0 L/ min；雾化器气体压力为45 psi；护套流速为11 L/ min，护套温度为350 ℃。毛细管电压为4000 V；喷嘴电压为1000 V；MS TOF碎片或电压为175 V；分离器电压为65 V；ESI的质量范围设置为m / z 100-1100。数据采集和仪器控制使用安捷伦Q-TOF MassHunter工作站软件（版本B08.00）进行。

2.3在线电化学模拟

在进行电化学模拟之前，使用50％的乙腈精确制备20％的甲酸铵溶液。通过添加25-28％的氨水来调节20％的甲酸铵溶液的pH值。最后，获得了pH值为7.4的20 mM甲酸铵缓冲溶液并将其用于整个电化学实验过程。因此，用20％甲酸铵溶液制备了目标化合物的100 M标准溶液，将所有制备的溶液过滤通过0.22 micro;m尼龙过滤器。

在阶段Ⅰ电化学反应中，用玻璃注射器以10 L/ min的流速，将100 M标准溶液泵入装有工作电极的反应池中。通过开启薄层细胞，质谱检测仪可以在线监测各种介质中氧化产物的代谢物。记录下来的质量伏安图是通过工作电极电位从100到4000 mv的线性增加得到的。

将准备好的100 m标准参比溶液引入到反应室中。接下来，将包含研究目标分析物（阶段Ⅰ中创建的）氧化产物的溶液离开反应器池，在与被分析物相同的缓冲溶液中与100 micro;M谷胱甘肽溶液混合。利用位于薄层电池和AJS-ESI源之间的反应线圈，获得了潜在的氧化代谢物和GSH的阶段Ⅱ加合物形成。缓冲液中的谷胱甘肽通过T型管加入到盘管中，规定的流速为10 micro;L/ min。从盘管中流出的废水直接流入MS中。

2.4微粒体孵化

所有目标化合物的培养均采用大鼠肝微粒体进行。以50 mM磷酸盐缓冲液(ph 7.4)为培养基，以磷酸二氢钠和磷酸二氢钠混合溶液为原料制备培养基。在目标化合物阶段Ⅰ代谢中，将100 mM目标化合物和肝微粒体的最终浓度加入磷酸盐缓冲液中，然后在37 ℃预培养5 min。随后，在所有样品溶液中加入MgCl₂和NADPH，最终得到500毫升的总体积；混合物接着再培养90分钟。作为阶段Ⅰ代谢产物，谷胱甘肽被加入到混合溶液中，与代谢产物发生反应。在规定的培养时间后，加入500毫升ACN终止反应。然后样品混合物在13,000转/分钟离心5分钟去除蛋白质沉淀。采用超高效液相色谱-质谱联用仪对产生的上清液进行分析。

3结果和讨论

3.1阶段Ⅰ和阶段Ⅱ代谢的电化学模拟

通过EC / MS模拟代谢，建立了四种生物碱在甲酸铵缓冲液中的氧化代谢行为。在一系列电压下比较了生物碱原型和代谢产物的峰强度，以选择电化学氧化的最佳电压。图2显示了在一系列电压下被氧化的四个目标化合物的3D MS伏安图。使用Q-TOF / MS的监测控制平台收集了氧化样品的数据，并通过定性分析程序进行了分析。获得了准确的分子量，并鉴定了潜在的代谢产物。进行了目标分析物到阶段Ⅰ氧化产物及其阶段Ⅱ代谢产物（谷胱甘肽共轭物）的转化在大多数情况下，主要检测到三种类型的代谢物；一种代谢物对应于质量减少了14 Da，这可以用去甲基化过程解释，而第二种代谢物的质量增加了14 Da，这可能是由于羟化作用导致CH₂的损失。第三种代谢物对应于去甲基化产物，其质量增加了16 Da。

图2在EC / MS设置中生成的生物碱和代谢物的质谱图（A）BBR，（B）COP，（C）JAT和（D）PAL；M3、M4、M5、M6、M7和M8的最佳电压分别为2000、2000、1800、400、400、1800、2000和代谢物

3.1.1鉴定BBR的代谢产物

图2A显示了针对BBR获得的3D MS伏安图。电位范围（200-4000 mV）和质量范围（m / z250-430）提供了原型和氧化产物的概述。在低电位下，观察到原型BBR的信号，为质子化分子离子（C₂₀H₁₈NO₄），m / z为336.1236。从1600 mV电压开始，这些信号强度显着降低，同时出现了新的产品信号。支持信息图S1和图3分别显示了所有代谢物的概况，包括质谱图和可能的结构式。通过ESI源以全扫描模式分析了I相氧化产物，包括与BBR代谢产物有关的八种产物。支持信息图S2中显示了每种代谢物的最佳电压。M1、M2、M1和M2分别在m / z 322.1072处显示信号峰，比原型化合物的峰低14 Da（CH₂），表明它从BBR中损失了一个CH₂。因此，初步确定了小檗碱和噻唑林衍生物（C₁₉H₁₆NO₄）的M1和M2，它们可能是目标化合物的代谢产物。

在正离子模式下观察到的m / z 324.1229（M3）峰可能是BBR的开环中间体BBR（C₁₉H₁₈NO₄）可以被预先切割成去甲基化的BBR。推测在m / z 338.1320处出现的信号峰是由于BBR的还原产物引起的，因为它比原型化合物低2

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