生物铂与生物钯纳米粒子—— 去除药物的新型催化剂外文翻译资料

生物铂与生物钯纳米粒子——

去除药物的新型催化剂

原文作者 Monica Martins 单位 昆士兰理工大学生物学研究所

摘要：药品是环境中最令人担忧的新兴污染物之一，研究有效的去除药物的方案至关重要。铂纳米粒子（Bio-Pt）的生物合成已有研究，但从未报道过其催化活性。在这项工作中，我们探索了用寻常脱硫弧菌合成的细胞负载铂（Bio-Pt）和钯（Bio-Pd）纳米颗粒作为生物催化剂去除四种常见药物：环丙沙星，磺胺甲恶唑，布洛芬和17b-雌二醇的潜力。同时将生物纳米颗粒的催化活性与寻常小球藻全细胞的药物去除效率进行了比较。与生物钯相比，生物铂具有较高的药物去除催化活性，其中17b-雌二醇，磺胺甲恶唑和环丙沙星的去除率分别为94％，85％和70％。此外，与生物铂反应后，17b-雌二醇的雌激素活性大大降低，表明该生物催化剂产生的毒性较小。虽然布洛芬没有被生物钯或生物铂去除，但研究发现其被脱硫弧菌全细胞完全清除，这表明硫酸盐还原菌是在厌氧环境中能够促进布洛芬生物转化的微生物之一。这项研究首次证明了生物铂具有很高的催化活性，是一种有望用于水处理过程中的催化剂，用于去除抗生素和内分泌破坏性化合物。

关键词：药物化合物；生物纳米颗粒；铂；脱硫弧菌；还原催化

1.简介

药品在环境中的广泛存在已成为一个世界性的问题。 在全球范围内，成千上万种不同的活性化合物用于人类医学和兽医学领域，大多数以原药形式或活性代谢产物排出体外。由于它们在废水处理厂中的去除效率不高以及工业废水的处理不当，大量药品不断被排放入环境中。这些药物污染物不仅在药物中被检测到，而且在地表水，海水和地下水甚至饮用水中都检测到了这些污染物。尽管通常检测到它们的浓度较低，但它们在环境中的持续累积仍可能对人类和动物健康以及生态系统产生有害影响。

最具问题的药物是非甾体类抗炎药，雌激素和抗生素。雌激素普遍存在于水生系统中，有强有力的证据表明它们会影响鱼类、爬行动物和水生脊椎动物的繁殖力和发育。抗生素也是一个严重的环境问题，因为即使在残留水平，它们也可以在细菌种群中诱导耐药性。为了防止药物污染环境及其可能的不利影响，必须制定新的策略以从废水中去除这些污染物。高级氧化过程，例如UV/H₂O₂，UV/O₃和UV/TiO₂，是药物降解研究最多的过程。但是，这些技术需要高投资和高运营成本，在某些情况下会产生多种诱变和有毒化合物，从而加剧了环境一问题。

基于金属纳米颗粒作为催化剂的修复工艺是一种非常有前途的废水处理方法。与寻常催化剂相比，纳米催化剂的表面积体积比大。此外，使用生物合成的纳米材料是一种清洁，无毒且环保的方法。在金属纳米颗粒中，生物钯纳米颗粒作为还原性去除几种环境污染物（Cr（VI），聚氯联苯基，三氯乙烯和偶氮染料）的有效催化剂已经出现。但是，他们在去除药物中的应用一直没有得到很好的研究。迄今为止，仅报道了使用Bio-Pd和混合的Bio-PdAu对双氯芬酸（一种非甾体类抗炎药）进行脱氯的方法。另一方面，生物铂纳米粒子的合成研究要比Bio-Pd少得多，并且它们的催化潜力是从来没有调查过。在这项工作中，我们首次评估了两种生物金属纳米颗粒（Bio-Pd和Bio-Pt）作为催化剂去除四种最有问题类别的药物的潜力：一种非甾体类抗炎药（布洛芬） ，一种雌激素（17b-雌二醇）和两种抗生素（磺胺甲恶唑和环丙沙星）。使用微生物脱硫弧菌合成了生物金属，并在硫酸盐还原条件下将其催化活性与脱硫弧菌全细胞的药物去除效率进行了比较。

2.材料和方法

2.1 化学试剂

布洛芬和17b-雌二醇从Sigma公司购买，而磺胺甲恶唑和环丙沙星从Fluka购买。储备溶液（3 g L^-1） 布洛芬，17b雌二醇和磺胺甲恶唑是通过在乙腈中溶解每种化合物制备的，而环丙沙星是溶解在用冰醋酸酸化的蒸馏水中（5mg L^-1). 所有药物库存解决方案都存储在20℃。钯和铂储备溶液（1 g L^-1） 通过将氯化钯和氯化铂（均来自Sigma-Aldrich）分别溶解在用HCl（pH 2.5）酸化的蒸馏水中制备。四种药物化合物的化学结构如补充资料部分的图S1所示。

2.2. 微生物和生长条件

本研究使用D.vulgaris Hilden borough（DSM 644）进行。该菌株在含0.5 g L^-1的改良Postgate培养基（pH7.2）中生长。KH₂PO₄ 1g L^-1, NH₄Cl2.5g L^-1, Na₂SO₄，0.06g L^-1,CaCl₂ 0.06 g L^-1, MgSO₄ 1g L^-1，酵母提取物0.007 g L^-1。

2.3. 生物铂和生物钯纳米颗粒的合成

生物铂和生物钯的制备是根据Humphries等人进行的。对数期结束时收集D.vulgaris细胞，离心（2500xg、 10分钟），用厌氧MOPS/NaOH缓冲液（pH 6.8，20 mM）洗涤两次，并在同一缓冲液中再悬浮。使用注射器将已知体积的浓缩细胞悬液转移到含有金属溶液（pH 2.5，100 mg L^-1金属）。以厌氧方式制备金属溶液：将已知体积的金属储备溶液添加到含有煮沸和脱气水的血清瓶中。在1小时内再次用N₂冲洗溶液，然后用丁基橡胶塞和铝卷曲密封件密封瓶子。在添加浓缩细胞后，在5分钟内用N₂冲洗溶液。添加细胞以得到最终的干细胞比率电池：金属3:1（w/w）。37℃孵育1小时后为了金属生物吸附，用H₂冲洗金属负载电池，并在37℃下过夜,在H₂（0.8bar）的顶空超压下。在确认金属完全沉淀（溶液中的金属量按第2.9节所述分光光度法测定）后，通过离心（3000xg、 10分钟），用蒸馏水清洗两次，用丙酮清洗一次，并在室温下过夜干燥。将干燥的固体研磨成细粉，用于催化分析。

2.4. 金属负载细菌细胞的透射电子显微镜（TEM）

在与H₂过夜孵育后，收集金属负载细菌细胞，通过离心（2500xg、 10分钟），用蒸馏水洗涤两次，并用2.5%（w/v）戊二醛固定。将颗粒离心（3000xg、 10min），再悬浮于2%（w/v）低熔点琼脂糖中，用0.1m磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗涤。未染色的金属负载细胞通过分级乙醇系列（30、50、75、90和100%）脱水并包埋在EPON树脂中。切下薄片，放在铜板上，用日立H-7650透射电镜观察。

2.5. 评价Bio-Pd和Bio-Pt去除药物的催化活性

在厌氧条件下，使用15ml血清瓶（含1mg金属细胞结合的纳米颗粒（占金属总质量的25%）和5ml含药物化合物的溶液（1mg L^-1). 所有药物溶液的pH值均调整为3.2，布洛芬除外，布洛芬的pH值调整为5.3，因为我们观察到其在低pH值下的化学降解。在20分钟内用N₂冲洗溶液，然后在10分钟内用H₂冲洗溶液，以激活生物催化剂。在0.8 bar H₂的血清顶空超压下进行测定。进行两项对照分析：i）未经H₂活化的药物和生物催化剂；ii）在H₂下但未经生物催化剂活化的药物。所有的分析都是在25℃的黑暗中进行的，一式三份。转速为150 rpm。研究了生物催化剂在去除药物中的可重用性。在每个实验循环结束时，通过离心（3000xg、 10分钟），用蒸馏水清洗两次，用丙酮清洗一次，并在室温下干燥过夜。进行洗涤以消除最终的药物和来自先前催化反应的可吸附到催化剂上的其他化合物。如前所述，回收的干燥固体在催化分析中重复使用。定期收集液体样品并通过过滤器过滤。

2.6. 普通芽孢杆菌细胞对药物去除效果的评价

使用上述培养基进行测定，但使用0.2 g L^-1酵母抽提物和补充2mg L^-1的药物。所有实验均在37℃使用含有30mL培养基和10%（v/v）接种物的50毫升玻璃瓶。先前获得的细菌细胞在2500xg下离心10分钟获得 ，用20 mM MOPS/NaOH缓冲液（pH 6.8）清洗，并转移到含有待测培养基的瓶子中。在无碳源（乳酸钠）的条件下，研究了脱硫弧菌细胞对药物的去除作用。对于每个实验，一个非生物控制是平行进行的。非生物对照的制备方法与生物试验相同，但不添加接种物。在其他对照组中，使用添加2 mg L^-1的培养基研究了硫化氢（6 mM）和热灭活细胞对药物的去除的药物。以无水硫化钠（Na₂S）的形式加入硫化氢。对于热灭活细胞的分析，通过离心（2500 xg、 10分钟）获得晚期对数期培养物,并用厌氧20 mM MOPS/NaOH缓冲液（pH 6.8）清洗细胞。细胞被高压灭菌（120℃、 30分钟），并添加到含有待测培养基的瓶子中。所有化验均一式三份。

2.7. 药物去除动力学

采用拟一级动力学拟合药物去除数据，并根据以下方程式计算去除速率常数（k）：

其中C和C₀是药物的浓度（mg L^-1） 分别在给定时间（t）和时间零点，t是反应时间（h）。

2.8. 雌激素活性测定

使用人雌激素受体转染（hER）的酿酒酵母菌株进行测定，以评估含有17b雌二醇的反应器中与生物源性纳米颗粒反应前后的相对雌激素活性变化。在英国布鲁内尔大学J.P.Sumpter教授的同意下，使用了转染了人类雌激素受体的酿酒酵母。本试验按照Routledge和Sumpter（1996）所述程序进行，并由Stanford和Weinberg（2010）进行了具体修改。在本试验中，17b雌二醇也被用作雌激素活性反应的参考。测定17b雌二醇的浓度和诱导50%最大反应（EC₅₀）的受试样品，以获得并比较样品的雌二醇当量（EEQ），使用以下方程式：

2.9. 分析方法

紫外可见分光光度计测量600 nm处的光密度（OD₆₀₀）来监测细胞生长，用紫外可见分光光度法在450nm处测定硫酸根的含量。根据USEPA 375.4参考方法的磺胺弗方法。钯（II）的浓度在236nm处用分光光度法测定，而铂（IV）则用SnCl₂定量。通过将500 mL样品与400 mL HCl（6 M）混合，然后添加100 mL SnCl₂（1 M于2.5 M HCl中）来测定溶液中Pt（IV）的浓度。5min后，铂锡络合物在403nm处用紫外可见分光光度法定量。药物的浓度通过高效液相色谱法（HPLC）测定，使用Alliance 2695 Waters系统，配备UV检测器。Luna C18柱（150x3.0 mm，5 mm，Phenomenex Inc.，Torrance，CA，USA）用于分离药物。采用梯度条件和50ml的进样量对所有药物进行定量。布洛芬以70%乙腈和30%磷酸（10mm）为流动相，洛芬和17b雌二醇在220nm处检出，环丙沙星在275nm处检出，磺胺甲恶唑在270nm处检出。

三、结果与讨论

3.1 通过生物Pd和生物Pt去除药物化合物

由于其还原金属的能力，硫酸盐还原菌（SRB）不仅常用于去除有毒金属如Cr（VI）和，而且还用于制备具有高催化活性的金属纳米粒子。在这项工作中，我们合成了生物纳米铂（生物铂）和钯（生物钯）使用D.vulgaris和评估其去除药物的潜力。

3.1.1. 金属负载细胞的TEM分析表明

普通草被成功地钯化和铂化（图1）。在这两个案例中，在细胞表面和周质空间都观察到致密的金属沉积。此外，析出的金属大部分是纳米级的。这些结果与先前的研究一致，这些研究报告了SRB细胞周围存在致密的金属沉淀物。D.vulgaris的基因组编码七个阶段，它们是参与金属还原的假定酶。其中四个是周质相，而三个在细胞质内或面向细胞质。金属沉淀的存在与金属还原过程中的周质相一致。由于细菌表面是金属吸附的良好成核点，因此在细胞表面也观察到了金属前环氧化物。在周质内生物还原后，金属沉淀物生长并通过细胞表面积聚的外膜喷发（图1）。

图1 细胞负载钯纳米颗粒（a，b，c和d）和铂纳米颗粒（e，f，g和h）的TEM图像

3.1.2. 药物去除动力学

氧化法一般应用于有机物的处理。还原催化在去除几种环境污染物方面也被证明是有效的，与高级氧化工艺相比，它的优点是产生的毒性和致突变分子较少。然而，其在药物去除中的应用研究却很少。到目前为止，仅对两种非甾体抗炎药（双氯芬酸和布洛芬）的去除情况进行了评估。在这项研究中，生物铂和生物钯的催化潜力，去除四个药物属于不同的类别进行了评估。我们选择研究具有可被还原的化学基团的药物，同时也是环境中最相关的药物，包括布洛芬、环丙沙星、磺胺甲恶唑和17b雌二醇。生物铂和生物钯对这四种化合物的去除如图2所示。在没有H₂的情况下进行的分析也测定了

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