三种不同活性醛对牛血清白蛋白孵育诱导产生高级脂氧化终产物的诱导作用研究外文翻译资料

三种不同活性醛对牛血清白蛋白孵育诱导产生高级脂氧化终产物的诱导作用研究

Wenjuan Li^1rsquo;2，Haiyan Gao^1rsquo;2，Honglei Mu²，Hangjun Chen²，Xiangjun Fang²，Yongjun Zhou² and Fei Tao²

College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu，P. R. China

Food Science Institute，Zhejiang Academy of Agricultural Science / Key Laboratory of Fruits and Vegetables Postharvest and Processing Technology Research of Zhejiang Province，Hangzhou，Zhejiang，P.R. China

摘要：众所周知，高级脂质氧化产物（ALES）与许多慢性和退行性疾病有关。在这里，我们提出了合适的方案来描述和比较来自不同脂肪氧化二次产物的ALES。这些结果增强了我们的知识 了解ALE的特点，有助于我们了解不同脂质氧化产物产生的ALE的结构和形成。此外，我们的研究结果也为采取适当的预防或预防措施来抑制或减少ALE提供了重要的见解。

关键词：高级脂质氧化终产物；氨基酸修饰；构象变化；脂质氧化产物

一、引言

由于其生理功能，PUFA引起了人们对各种研究领域的兴趣。Adany膳食PUFA（例如，DHA、EPA、亚油酸和亚麻酸）易受脂质氧化的影响，这与不稳定脂质氢过氧化物的形成有关。这些化合物可以分解成反应性羰基（rcs），如醛和酮，它们在亲核部位（特别是Lys、Arg、Cys和His残基）共价修饰蛋白质，从而产生各种加合物和交联，统称为高级脂质氧化终产物（ALES）。

ALES的积累参与了不可降解溶酶体内脂褐素样色素（lflps）的形成，其特征是荧光和黄棕色，这是蛋白质老化的最典型特征之一。ALES的积累也会引起蛋白质的结构和功能的变化，并与许多慢性和退行性疾病有关，如阿尔茨海默病（AD）、糖尿病、各种代谢疾病、类风湿性关节炎、肥胖、肾病、心血管病、动脉粥样硬化、慢性肺病和神经胶质瘤。生殖疾病。此外，对ALES影响的生物学研究，特别是通过4-羟基-trans-2-壬醛（HNE）、丙二醛（MDA）和4-氧基-trans-类似-2-壬醛（one）对蛋白质进行修饰，表明这些高RCS大部分是富含pufa的细胞膜的氧化产物。另外一些a，p-不饱和醛，如庚烯醛和庚二烯醛，也在ALES的形成中起着重要作用。然而，这些化合物尚未得到很好的研究。因此，需要对ALES进行进一步的研究，以阐明ALES的详细生化特征，尤其是庚烯醛和庚二烯醛，这是从食物（如亚油酸和亚麻酸）中自动氧化pufa后确定的重要分解产物。

美拉德反应是一个很好描述的过程，涉及氨基酸或蛋白质的非酶糖基化，形成高级糖基化终产物（AGES），其特征是具有特定的颜色、荧光、紫外可见（UV-VIS）光谱吸收率和分子内或分子间交联。近年来，AGES具有e在许多研究领域进行了研究，包括生物系统的研究。就化学反应性而言，脂质氧化产生的RCS应表现为羰基固定gt;M碳水化合物或碳水化合物氧化，并应经历类似的反应以形成ALES/年龄。此外，由于年龄（即美拉德反应产物）和ALE的反应涉及常见的中间产物、降解途径和聚合途径，从而产生黑色素/脂褐素样大分子，研究人员建议应同时考虑这些反应，以了解MEC的反应，更进一步，一些研究甚至建议，ALE和年龄应被视为晚期糖基化或脂质氧化最终产物（EAGLES）。因此，我们假设年龄的表征方法（通过美拉德反应）可以为ALES的研究提供新的线索。

在本研究中，我们评估了三种不同的ALE形成模型系统，其中牛血清白蛋白（BSA）在不同浓度的丙二醛、反式-2-庚烯醛或RRA、W、RRA、W-2,4-庚二烯-三种不同不饱和度的活性醛中培养。然后，我们对这些蛋白质醛加合物的荧光、侧链修饰、颜色、光谱性质、聚集状态和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）图谱进行了表征。通过这些分析，我们深入了解了从这些醛类中提取的牛血清白蛋白的特征，并比较了牛血清白蛋白的特征和年龄。这些数据将有助于我们理解来自不同前体的ALE，并有助于制定适当的预防或治疗措施，以抑制或减少ALE的产生。

二、材料和方法

2.1材料

丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、溴酚蓝、过硫酸铵和四甲基乙二胺（Temed）购自Amersham Biosciences（瑞典乌普萨拉）。电泳用分子量的蛋白质标准来自中国强苏市贝奥蒂姆生物技术有限公司。反式-2-庚烯醛购自东京化学工业有限公司（日本东京）。9,10-菲醌、邻苯二甲酸二醛、反式-2,4-庚二烯和盐酸胍购自阿拉丁工业公司（中国上海）。BSA购自上海博澳生物科技有限公司（中国上海）。所有其他化学品均为分析试剂级。

2.2 BSA准备

通过在37℃的黑暗中培养BSA（lomg/ml，溶于0.05 m磷酸盐缓冲液中，pH7.0），在不同浓度（2.5、5、10、15或20 m m）的MDA、traris-2-庚烯醛（以下简称庚烯醛）或trans、trans-2,4-庚二烯醛（以下简称庚二烯醛）24 h制备BSA ALES。根据Wu的描述制备MDA溶液。等。〔15〕。在相同条件下，未添加修改器的本地BSA用作控件。游离醛在4°C与去离子水透析培养72小时后被去除。然后冷冻干燥改性蛋白溶液，并在4°C下储存，直到随后的分析。孵育三次。

2.3游离氨基和精氨酸基团的测定

如Wong等人所述，采用opa分析稍作修改来评估可用赖氨酸，。OPA试剂制备如下。首先，将160毫克邻苯二甲醛溶解于4毫升乙醇中。然后添加5毫升20%SDS溶液，然后添加0.4毫升巯基乙醇，用0.1 M硼砂缓冲液（pH9.8）配制成200毫升的体积。将适量蛋白与3ml蛋白石试剂混合，在黑暗中RT孵育3min。然后在340 nm处测量吸光度。以赖氨酸为氨基酸标准，测定了可用NH2组的数量。

2.4羰基含量的测定

使用2,4-二硝基苯肼（dnph）测定了BSA中羰基的引入。羰基含量用22000 m^-1 cm^-1的摩尔消光系数计算。对每种醛浓度的三个独立样品进行分析。

2.5牛血清白蛋白类脂褐素荧光光谱的测定

如Patkova等人所述，在F-2000荧光分光光度计（日本东京日立）上测量BSA ALES的LFLP荧光光谱。〔20〕。三维等值线图显示了LFLP荧光光谱的最大激发波长和发射波长的更好概述，激发波长在300-410 nm范围内测量，发射波长在320-550 nm之间测量。对于LFLP荧光光谱的定量（BSA ALES的浓度为0.5 mM^ml，在0.2 mPBS中，pH7.0），使用3D光谱中发现的激发和发射最大值。用荧光强度（FI）表示LFLP含量。对每种醛浓度的三个独立样品进行分析。

2.6 TRP荧光测量

用F-7000荧光分光光度计（Hitachi）在280 nm（狭缝宽度，10 nm）激发波长下监测天然BSA和醛改性BSA（0.25 mg/ml）色氨酸残基的荧光，并在300至400 nm（狭缝宽度10 nm）范围内记录发射。对每种醛浓度的三个独立样品进行分析。

2.7表面疏水性测量

根据Huang等人的方法稍作修改，用1-苯胺-8-萘磺酸盐（ANS）测定表面疏水性。在0.05 m磷酸盐缓冲液（pH7.0）中重新悬浮天然和改性的BSA，以获得0.005到0.5 mg/ml的蛋白质浓度范围。然后，在1 ml蛋白质溶液中添加15 jxl的8 mAns溶液（在0.05 m磷酸盐缓冲液中，pH7.0），并在390 nm处记录发射FI（480-490 nm）作为激发波长，使用F-7000荧光分光计（日立）。通过线性回归分析计算的FI与蛋白质浓度曲线的初始斜率被认为是蛋白质疏水性（HO）的指标。对每种醛浓度的三个独立样品进行分析。

2.8紫外线-可见光和颜色测量

在10 mm路径长度的石英试管中对BSA ALES水溶液（0.2 mg/ml，0.05 m磷酸盐缓冲液，pH7.0）进行紫外-可见光谱和吸光度测量。读数在240到600纳米之间，并用GBS Cintra 20/404紫外/可见分光光度计记录。

用色度计测定不同BSA-ALE样品的颜色。在测量前对仪器进行校准，并使用CIE颜色系统记录结果。测量参数如下：A*（--红-绿分量）和B*（ 黄-蓝分量）。对每种醛浓度的三个独立样品进行分析。

2.9电泳

SDS-PAGE使用5%凝胶凝胶和12%分离凝胶进行垂直凝胶电泳。在还原性样品缓冲液（含2%十二烷基硫酸钠、5%对巯基乙醇、0.02%溴莫泊酚蓝、10%甘油和0.01 M三羟甲基纤维素缓冲液，pH8.0）中重新溶解天然和修饰蛋白。将5微升样品溶液（2.5 mg/ml）装入每个细胞，并在恒定电流（20 mA）下进行电泳。考马斯亮蓝R-250（0.1%）在45%（v/v）甲醇和10%（v/v）乙酸中对蛋白带进行染色。用10%甲醇和10%乙酸进行脱矿，对凝胶进行三次运行，以确认结果的重复性。

2.10统计分析

分析了每种醛浓度的三个独立样品。结果表示为平均土sds（w=3）。使用SPSS16.0软件，通过方差分析确定平均值之间的显著差异。使用的显著性水平为95%。

三、结果和讨论

3.1蛋白质侧链修饰

3.1.1赖氨酸和精氨酸的修饰

蛋白质表面存在的游离氨基和精氨酸胍基总是参与衰老和ALES的形成。用不同浓度的三种醛培育BSA后，这两种氨基酸残基的改性百分比变化如图ib和c所示。改性BSA中的游离胺和精氨酸均随三种醛浓度的增加而不断降低。在浓度为20 mM的不同醛处理之间，自由胺和精氨酸的变化具有统计学意义（plt;0.05）。将BSA与20 mM的丙二醛、庚烯醛或庚二烯孵育，分别对赖氨酸残基进行57.68土3.88%、20.02土0.91%和31.11土1.58%的修饰。此外，我们的研究结果表明，在37℃孵育24h后，9.08土1.40%、20.42土1.24%和30.20士2.33%的精氨酸侧链分别被20 mM丙二醛、庚烯醛或庚二烯改性。

值得注意的是，丙二醛浓度的增加导致活性赖氨酸含量的显著降低。相反，丙二醛与精氨酸残基反应较弱。这些醛对赖氨酸的反应如下：丙二醛gt;庚二烯醛gt;庚烯醛。相反，醛对精氨酸的反应性为：庚二烯gt;庚烯醛gt;丙二醛。丙二醛的化学反应是由于它的活性羰基官能团，可以很容易地与亲核基团，如游离胺基和精氨酸胍基相互作用，形成席夫碱。此外，丙二醛和赖氨酸残基之间的反应可以形成w-丙烯醛赖氨酸，一种众所周知的加合物。另一方面，a，（3-不饱和醛具有多种可用于氨基酸亲核加成的反应基团。

羰基中的碳的电子缺陷可以通过a（3-不饱和醛中的双键来降低，而烯烃p-碳的电子缺陷可以通过吸电子和极化的移动电子来产生。这可能最终导致反应性较低的a（3-不饱和醛在Schiff碱形成中），但允许通过Michael反应与蛋白质的亲核氨基酸残基发生共价反应。当a，p_碳的双键由于Michael反应而饱和时，下一个反应是schiff碱的形成，这可能导致蛋白质进一步交联。此外，A（3-不饱和醛）的反应性随着不饱和度的增加而增加，因为双键会使醛更亲电。

这些醛的结构如图1a所示。观察到的这三种醛对不同氨基酸残基的活性差异可能是由于它们的反应类型和反应性不同。此外，氨基酸残基的亲核反应在一定程度上取决于它们自身的性质，并且受微环境和周围氨基酸残基的影响很大。这些因素都导致了醛和蛋白质之间加成反应的复杂性。

3.1.2羰基含量

蛋白质羰基化是羰基介导的蛋白质改性的一个重要指标，它不仅适用于老年人，也适用于麦芽糖。因此，我们接下来测量样品的羰基含量。在赖氨酸和精氨酸减少的同时，我们观察到蛋白质羰基含量增加（图ID）。从丙二醛、庚烯醛和庚二烯醛中可以检测到增强的羰基含量。如图ID所示，较高浓度的醛类导致蛋白质结合的羰基显著增加。在37℃下用20 mM的丙二醛、庚烯醛或庚二烯培育24小时后，我们观察到羰基分别比对照组增加12.38倍、8.33倍和7.06倍。从图1D可以看出，醛衍生的ALES的羰基含量水平可按如下顺序排列：MDA-bsagt;庚烯醛bsagt;庚二烯bsa。

一个丙二醛分子中有两个羰基：一个通过席夫碱反应与蛋白质侧链上的氨基加成残基共价结合，另一个自由羰基与dnph探针反应，从而增加改性蛋白质的羰基含量。庚烯醛或庚二烯醛与BSA的反应导致迈克尔加

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 12 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[279012]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word