利用来自Scheffersomyces stipites CBS 6045的酮还原酶高效合成(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇外文翻译资料

利用来自Scheffersomyces stipites CBS 6045的酮还原酶高效合成(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇

原文作者：Yue-Peng Shang, Qi Chen, Xu-Dong Kong, Yu-Jun Zhang,Jian-He Xu, and Hui-Lei Yua

单位： State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing, East China University of Science and Technology

摘要：通过酶切，克隆于Scheffersomyces stipitis CBS 6045酮还原酶（称作SsCR）被鉴定可以催化不对称氢化的各种芳香族酮类。SsCR展示了特定的65 Umg^-1的蛋白质活性和对疏水性底物2-氯代-1-（2,4-二氯苯基）乙酮优异的对映选择性（99.9％ee）。2-氯代-1-（2,4-二氯苯基）乙酮是合成常见的抗真菌药药物如咪康唑，益康唑和舍曲康唑的关键中间体。动力学参数Kcat / Km为4.51times;10 3 s ^-1 mM ^-1，显示了SsCR对该底物的极好的催化效率。分子动力学模拟结果揭示了该衬底相对于其它衬底的较高衬底结合自由能变化。基于SsCR的良好催化性能，可以获得（R）-2-氯-1-（2,4-二氯 - 苯基）乙醇，空时收率（STY）高达268gL ^-1 d^{- 1}，而且在还原反应过程中不需要任何额外的辅因子。在放大生物反应时，分离出（R）- 醇，产率为88.2％，ee值为99.9％。当排除过程水时，该反应的环境因子（E因子）为7.25。

关键词：生物催化;（R）-2-氯- 1-（2,4-二氯苯基）乙醇; 辅因子回收； 还原酶

前手性底物的不对称氢化被认为是制备光学活性化合物的重要方法。由于药物应用中对映异构体的不同活性，手性醇是药物合成的重要组成部分。（R）-2-氯-1-（2,4-二氯苯基）- 乙醇用于许多抗真菌剂的合成，如咪康唑，益康唑和塞替卡唑。根据BCC研究的新报告，到2018年，全球抗真菌治疗市场可能达到139亿美元。咪康唑是世界卫生组织基本药物清单中最重要的基础药物之一。 ^[3]因为对这种抗真菌剂的需求大，所以需要大规模的工业生产。

在不对称转移氢化过程中开发各种催化剂。 这些包括手性恶唑硼烷催化剂，手性金属催化剂和生物催化剂。手性恶唑硼烷催化剂的底物谱很广，^[4]产物的对映选择性与复合配体有关。 ^[5]基于过渡金属如铑，钌和铱的化合物是酮加氢中最受欢迎的催化剂。然而，过渡金属需要额外的螯合官能团用于高对映选择性，过渡金属的高成本是其工业用途的限制。

与化学催化剂相比，生物催化剂的主要优点是其无与伦比的选择性和环保性。^[6]脂肪酶在动力学上适用于各种手性醇的合成^[7]，但受到理论产率的50％的限制。已经开发并应用了导丝酶来实现酮的不对称氢化。贝克氏酵母细胞用于（S）-2-氯-1-（2,4-二氯苯基）乙醇的不对称合成，但冻干细胞的需求高达120gL ^-1。^[8]研究了耐热克鲁维酵母羰基还原酶（KtCR），以合成该（S）-产物，并具有约1.2Umg^-1蛋白的比活性。^[9]为了制备（R）-2-氯-1-（2,4-二氯苯基）乙醇，从火球菌（Pyrococcus furiosus）克隆PFADH。 [10] ee值高达99％，但在100 mL刻度的制剂中，时空产率（STY）仅为20 gL^-1 d ^-1。为了找到更有效的生物催化剂，Gotor等人筛选了许多乙醇脱氢酶，诸如ADH-T，ADH-PR2，ADH-CP，ADH-A，ADH-RS1和ADH-LB

在这些酶中，ADH-T具有较高的催化效率和对映体选择性。然而，生物还原体系中的底物负载量仅为6.7gL ^-1。低底物负载和STY显着阻碍了其工业规模应用。

在这里，我们已经开发了一种对各种卤代芳族酮具有高比活性的新型酮还原酶。为了鉴定催化还原2-氯-1-（2,4-二氯苯基）乙酮（10a）的酶，筛选出50种酶的活性（辅助信息，表S1）。在大肠杆菌中表达后，应用含有重组蛋白的无细胞提取物以分光光度法测定活性。 确定了十六种还原酶对10a的催化活性（图1）。在最佳对映选择性和活性的基础上，选择了名为SsCR的Scheffersomyces stipitis CBS 6045克隆的蛋白质进行进一步研究。

为了充分确定SsCR对衬底10a的催化性能，反应体系在催化剂用量，底物浓度和NADP 添加方面进行了优化。 所有的反应优化在含有10％v / v DMSO的水溶液中进行，以提高疏水性底物10a的溶解度。

使用100mM底物在10mL混合物[PBS 100mM，pH 6.5,2.5gL^-1 表达SsCR的冻干细胞，0mM NADP ，10KUL -1d葡萄糖脱氢酶来自巨大芽孢杆菌（BmGDH）]中进行初步实验] 。 12小时后，底物仅转化59％。当加入0.5mM NADP 以加速催化速率时，SsCR可以在2小时内完全催化底物转化为相应的（R）- 产物（表1，条目2）。 接下来，将底物负载量增加至300mM，但转化率仅为63％（表1，条目3）。12小时后，催化剂负载为5.0gL·l时为97％（表1，条目4）。 有必要将SsCR的用量提高到9.5 g/L，实现完全转化; 在6小时内，底物转化率达到99％（表1，条目5）。出于成本原因，优选不添加额外的NADP （表1，条目6），但在这些条件下，12小时后，底物的转化率仅为87％。 从这一系列优化实验中，我们得出结论，辅酶对催化剂的有效运行非常重要。在冻干的大肠杆菌细胞中，NADP 的内含量报道为1.86mmol / l。[11] 考虑到冻干大肠杆菌中NADP 的量，我们将SsCR的总剂量增加到12.5gL ^-1的冻干细胞，而不添加任何额外的辅酶。现在底物以99％转化率完全转化，催化剂的TTN估计约为1.26〜104。 类似于衬底10a，衬底11a的转化也以克刻度有效地转变为相应的（R） - 产物。 对于300mM底物11a，12.5gL ^-1 SsCR可以在3小时内完成转化。

相应的（R） - 产品有效地以克的规模。 对于300mM底物11a，12.5gL ^-1 SsCR可以在3小时内完成转化。 这些结果表明，SsCR是实现卤代芳香酮还原的有效催化剂，具有很好的应用潜力。

为了深入研究SsCR的催化性能，利用镍亲和层析纯化的蛋白质检测了各种芳族酮的比活性（图2）。 这些底物在苯环上含有不同的取代基并与羰基相邻。 对所有a-取代的酮（6a-11a）的具体活性都高于不同程度的苯乙酮。与其对氯取代基为3a的活性相比，SsCR显示出对底物10a和11a的显着更高的比活性，其在苯环的对位和羰基酮的a位上都具有额外的卤素取代基 在苯邻位。 许多还原酶，例如来自酿酒酵母的短链乙醇脱氢酶YMR226c 对苯基苯酚类似物的催化效率较差，仅在苯环上具有不同的基团。这些结果表明，在羰基酮的a位置具有吸电子基团的基底可以通过SsCR更有效地催化。SsCR对8a的活性高达124 Umg^-1，9高于KtCR的[9] SsCR可以催化底物10a，其比活性高达65.0Umg ^-1，高于KtCR的54倍。 如果苯环上的取代基变为氟，则SsCR对底物11a显示最高比活度为253U·mg^-1（参见图2）。 同时，衬底10a和11a的对映体选择性达到了99％的非常理想的水平。

在酶测定中测量纯化的SsCR对几种卤代芳香酮底物的动力学参数（表2）的Km值，10a的SsCR仅为2.44〜10〜2mM。 这表明该底物的结合亲和力高。 kcat / Km是评估酶的催化效率的非常重要的参数^[13] 对于具有底物10a kcat / Km的SsCR，达到4.51〜103sle;1mMle;1，表明催化效果良好。 基板11a具有与10a相似的化学结构，其kcat / Km为2.65times;10 ⁴ stimes;1mm ^-1。

根据使用Mechanics-Poisson Boltzmann分子（一般出生）/表面积（MM-PB（GB）/ SA）估算的结合能结果^[15]，计算出基底1a的结合自由能为-9.03plusmn;1.65 kcalmol^-1。 -14.29plusmn;2.79 kcalmol^-1和-19.67plusmn;2.57 kcalmol^-1 分别为基板6a和10a的结合自由能。 计算的结合自由能的总体趋势与实验确定的Km值一致

基于优化的条件（表1，条目7），将反应体积放大100倍至1L。将基板（67g）在308℃的恒温搅拌釜反应器中转化。 16h后，底物转化率达99％，99.9％ee。 反应混合物用两次萃取，将反应混合物用乙酸乙酯（EtOAc）萃取两次，然后蒸馏。使用饱和氯化钠溶液洗涤混合物以除去水和DMSO。最后收集到59.6g产品，产率为88.2％。高浓度疏水性底物的不对称还原反应由于其活性高，K m低而容易实现。值得注意的是，由于不需要添加额外的辅助因子，反应的成本降低。

根据绿色化学原理，这种基于还原酶的方法比过渡金属催化还原（涉及重金属）和动力学拆分（最大产率为50％）更环保。该减少过程的环境因素（E因子）显示在支持信息表3中。溶剂（EtOAc [92.3％回收率]和DMSO）损失（68％）是E因子的最高贡献者。将葡萄糖转化为葡萄糖酸钠，其占废物的18％。作为辅因子再生的辅助底物，葡萄糖具有成本效益。它也是可再生的，可以进一步利用生产的葡萄糖酸钠。 [16]如果排除水分，则E因子为7.25。 如果包括水，整个还原过程的E因子为27.4。

总而言之，鉴定出来自S.legitis CBS 6045，SsCR的新型还原酶，并且对各种卤代芳族酮，特别是2-氯-1-（2,4-二氯苯基）ACHTUNGTRENNUNG乙酮及其类似物具有极高的比活性。我们进行了一系列反应优化，以评估SsCR的催化性能。 在不添加额外的NADP 的情况下，SsCR可以在6小时内完全转化300mM的2-氯-1-（2,4-二氯苯基）乙酮。在这些条件下，STY高达268gL ^-1 d ^-1，TTN 为1.26times;10 ⁴。 当反应放大到1L时，该方法顺利进行，分离产率为88.2％，E因子为7.25（不含水）。我们的研究结果表明，SsCR作为卤代醇工业化生产的催化剂具有显着的潜力。

实验部分

酮还原酶的筛选

为了鉴定对底物10a及其类似物具有足够催化活性的酶，筛选了实验室中的还原酶试剂盒。基于NADPH吸光度的测定，克隆和表达后，在无细胞提取物中测定酶活性。 还原反应后，通过GC测定1mL的对映选择性。GC检测方法在支持信息中有所描述。

用SsCR生物还原2-氯-1-（2,4-二氯苯基）乙酮

为了探索SsCR对底物10a的催化效率，在克刻度上进行了几次还原反应。反应混合物如下：将底物10a（100mM，300mM），d-葡萄糖（1.5底物当量），SsCR（2.5gL ^-1,5gL ^-1，9.5gL ^-1，12.5gL ^-1冻干细胞） ，GDH（相当于冻干粗酶的1SsCR活性单位），NADP （0mM，0.5mM），PBS（100mM，pH6.5）和DMSO（10％v / v）。将这些反应在200rpm和308℃下搅拌直到反应停止。为了保持SsCR的稳定活性，使用1M NaOH将反应pH自动滴定至6.5。混合物用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥，然后用GC分析反应产物。所有反应在10mL反应器中进行优化。最终产物通过NMR鉴定¹ H NMR（CDCl ₃，400Hz）：d = 2.74（d，J = 3.6Hz，1H），3.52（dd，J = 8.28.4Hz，1H），3.88（dd，J = 11.2,2.8Hz，1H），5.27（m，1H），7.31（dd，J = 8.4,2.0Hz，1H），7.38（d，J = 2.0Hz，1H），7.58（d，J = 8.4Hz，1H）。这些数据对应于参考文献。 ^{[2b] 13} C NMR（CDCl ₃，100MHz）：d = 49.1,70.3,127.6，128.5,129.3,132.4,134.6,135.9。 [a] ²⁷ _D：-57（c 1.0，

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