结合斑马鱼和CRISPR/Cas9:朝向更多高效药物发现管道

Carles Cornet, Vincenzo Di Donato*和Javier Terriente*

ZeClinics SL, PRBB

摘要：在过去20年中，斑马鱼幼体在基础研究和应用研究中的应用呈指数级增长。其成功的原因在于其具体的实验优势:一方面，其体积小、子代数量多、生命周期快，在保持3Rs amenability的同时，大大方便了大规模的方法;另一方面，斑马鱼幼虫与人类的高度遗传和生理同源性，以及易于遗传操纵，使其成为理解人类疾病的高度健壮的模型。综上所述，这些优势使得利用斑马鱼幼虫进行高通量的化学和遗传表型筛选研究成为可能。因此，斑马鱼幼体作为动物模型，被置于更简化的体外高通量筛选和信息丰富但低通量的哺乳动物临床前试验之间。然而，尽管斑马鱼具有生物学上的优势和不断增长的转译验证，它仍然很少用于目前的药物发现管道。在一个上下文制药行业正面临着生产力危机带来新的药物市场,斑马鱼的综合优势和CRISPR / Cas9系统,最强大的基因组编辑技术到目前为止,有潜力成为一个有价值的工具,用于简化模型模拟人类疾病的产生,新药物靶点的验证和发现新疗法。本综述将重点介绍CRISPR/Cas9在斑马鱼体内的最新进展及其在生物医学研究和药物发现中的所有潜在用途。

关键词:CRISPR/Cas9，药物发现，斑马鱼，疾病模型，表型药物筛选，功能基因组学

制药行业的生产力危机

引用:

在过去的几十年中，进入市场的新治疗药物的数量(NTD)与研发支出之间的比例出现了重要的下降(Paul et al.， 2010;Scannell等，2012)。因此，尽管有数十家生物技术公司的创建和快速增长，以及重要的并购交易，生物制药行业正遭受生产力危机。这种危机主要是由于进入临床试验的分子的药物消耗率极高(Kola和Landis, 2004)，其中95%的化合物失败

在临床II期和III期之后。镇痛药的主要来源是药效不足，占50%，因安全责任造成的消耗占25% (Waring et al.， 2015)。这种巨大的流失率导致新台币进入市场的平均成本为25亿美元(DiMasi et al.， 2016)。这种经济负担阻碍了行业的发展，限制了其对投资回报(ROI)不明确的疾病的承诺，如罕见的、第三世界或复杂的第一世界疾病(Schmid and Smith, 2007)。最近的一个例子是辉瑞公司决定中断他们的阿尔茨海默氏症和帕金森症的研究项目(Reuters.com, 2018)。对于低临床批准率，有两个主要因素需要考虑:(i)临床前阶段对人类安全性和有效性的预测能力如何，以及(ii)选择药物靶点以应对特定疾病的合适程度如何。

关于临床前阶段的可预测性，值得指出的是，所有在临床阶段失败的药物都经历了一个被认为是全面的临床前阶段。因此，NTD的低接受率表明，临床前阶段收集的信息，特别是从动物模型中获得的信息，对人类患者的毒副作用和治疗效果的预测低于预期(Scannell and Bosley, 2016)。因此，有必要制定策略，提高现有临床前动物模型的预测价值，并/或将其与更好的硅酸盐和体外工具相结合，以便在进入昂贵的临床前和临床阶段之前缩小最有希望的候选范围。在如何选择药物靶点的问题上，随着对一种疾病及其相关生物学途径的深入了解，临床成功明显增加。因此，调节与病理直接相关的靶点的药物在临床前和临床阶段均有较高的成功率(Nelson et al.， 2015)。不幸的是，识别基因疾病的关联并不是一项简单的任务，甚至可能无法找到合适的药物靶点。一个范例是脂肪质量和肥胖相关蛋白(FTO)基因:顾名思义，该基因中识别的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorsms, SNPs)与肥胖和2型糖尿病风险相关(Loos and Yeo, 2014)。在这种情况下，基因和病理之间的联系仍然是无可争议的;然而，已经有研究表明，在FTO内含子1和2中识别的snp实际上与人类大脑中IRX3的长期正调控有关。有趣的是，IRX3过表达对动物模型体重增加有明显的影响，与肥胖患者样本的表达数据有明显的相关性(Smemo et al.， 2014)。药物发现项目目标的准确数字FTO治疗肥胖和2型糖尿病是未知的,但发现Smemo et al .(2014)——通过结合实验数据从几个动物模型包括斑马鱼——说明进行详细的基因功能研究的需要(例如在进入昂贵的药物研发项目之前。总而言之，无论是由于临床前预测能力较低，还是由于靶点选择不当，生产率下降和药物消耗高，都凸显了简化药物发现流程的创新策略的必要性(Plenge, 2016)。

斑马鱼的研究和生物医学应用

斑马鱼:从基础研究到药物发现

斑马鱼是一种小型淡水鱼，几十年来一直被用作经典的发育生物学研究模型(Streisinger et al.， 1981;Kimmel, 1989)。自20世纪90年代以来，它的使用呈指数增长，当时一些基因筛查显示出这种动物模型在识别和表征涉及脊椎动物发育和疾病的新基因方面的潜力。斑马鱼的特殊特性，如大量后代和幼虫的外部发育，生命周期快，体型小，透明度高，可以进行大规模的基因筛选，这在哺乳动物模型中是无法实现的(Driever et al.， 1994;Haffter和Nusslein-Volhard, 1996;劳森和沃尔夫，2011)。这类筛选遵循了先前对秀丽隐杆线虫和果蝇的研究(Brenner, 1974;但是，鉴于脊椎动物模型能够在比无脊椎遗传模型更接近人类生物学的环境中识别和验证基因，它们本身就是革命性的。如今，对斑马鱼的研究已经从基础研究扩展到大多数转化生物医学领域。三个附加功能有了转变:第一,sim;83%的人类疾病相关基因在斑马鱼功能直接同源(豪et al .,2013),表明在人类疾病可以忠实地在斑马鱼模型。事实上，对于癌症等多种适应症，情况也是如此(Terriente and Pujades, 2013;White et al.， 2013)， cardiovascular (Asnani and Peterson, 2014) or neurologic diseases (Clark et al.， 2011)。其次，肝、肾和组织屏障从早期发育起就具有功能性(Parng, 2005)。因此，斑马鱼生理学概括了哺乳动物的药物代谢特征——吸收、分布、代谢和排泄(ADME)——并提供了事实上的芯片上的实验设置。第三，斑马鱼幼体在受精后5天(dpf)开始独立喂养前，不被动物福利条例视为动物。因此，在研究中使用斑马鱼幼体直接影响动物模型的替代、减少和细化(3Rs)，这是提高制药和化工行业伦理标准的一个关键方面(Avey et al.， 2015)。这些事实表明，更广泛地使用斑马鱼可以使生物医学界简化药物发现过程。在这个意义上，监管机构建议使用这种和其他小动物(FDA, 2004)。然而，在被监管机构和制药行业完全采用之前，通过斑马鱼发现药物可能需要更好的验证和对人类生物可译性的更深理解。为了在验证方面取得进展，几项研究集中于研究斑马鱼和人类收集的数据之间药物活性的相关性有多精确(Milan et al.， 2003;Ali et al.， 2011;Cornet等，2017)。这些研究表明，使用斑马鱼可以预测80%以上药物的毒性。关于生物可译性，我们在上面阐述了人类在基因、蛋白质结构和生理上的高度保守性。然而，为了进一步证明斑马鱼模型在药物发现过程中的适用性，一个重要的步骤将是开发人性化的斑马鱼模型，在该模型中，天然基因将通过其人类同源体进行交换，从而再现相同的生物通路，但具有完整的人类靶蛋白结构。这一特点为药物靶向相互作用提供了可靠的证据。无论如何，都需要斑马鱼研究界的共同努力来完全克服这些“验证”和“可译性”的挑战。同时，我们将在下面讨论斑马鱼在今天的药物开发中所取得的一些特点和一般优势

斑马鱼:加快药物发现的进程

传统上,制药行业已经使用两个主要的策略来发现新的药物靶向性药物检查,确定药物的体外基于属性绑定到特定的分子目标(例如,重组蛋白)和表型药物检查,药物发现,体外或体内,基于修改疾病表型的细胞、组织或有机体。通过表型筛选确定相关药物靶点通常很慢，有时甚至不可能。这一事实使制药业的努力转向以目标为基础的筛选。然而，与表型药物筛选相比，这些策略的药物发现成功率较低(Swinney and Anthony, 2011)。如今，在硅和体外靶标识别工具上的创新使得分子靶标的测定更快、更精确(Schenone et al.， 2013;cet al.， 2015)，这是定位表型药物发现回到趋势(Kotz, 2012)。

尽管有上述的一些挑战，斑马鱼是一个非常适合和可靠的进行表型药物发现的实验模型。事实上，斑马鱼的使用已经在三个不同的方面帮助了制药业。首先，通过对人类患者群体进行基因组筛选，验证潜在的药物靶点(Liu et al.， 2013);其次，通过生成新的疾病模型来更好地理解发病机制(Ablain and Zon, 2013);第三，利用这些疾病模型或其他生物特征，作为进行表型药物筛选的基础，以识别新的治疗方法(MacRae和Peterson, 2015)。一些例子有:保护内耳纤毛细胞免受抗生素毒性的Proto-1 (Coffin et al.， 2010);PDE5A治疗Duchenne肌营养不良的抑制剂(Kawahara et al.， 2011)，目前处于临床阶段;或BMP抑制剂Dorsomorphin，用于治疗进展性骨化纤维发育不良(Yu et al.， 2008)。

CRISPR/Cas9技术(Hwang et al.， 2013)在斑马鱼和精确基因组编辑技术中的直接应用(Hwang et al.， 2013)简化了疾病建模、目标验证和药物发现的过程。

CRISPR / Cas9在斑马鱼，有几种方法已经被开发并应用于斑马鱼中来改变基因转录和功能(Koster and Sassen, 2015)。其中，CRISPR/Cas9是一种允许快速准确编辑基因组的系统，它已经成为斑马鱼和其他模型系统中应用最广泛的技术。CRISPR/Cas9实验基础和一般应用之前已经得到了广泛的综述(Hsu et al.， 2014;Barrangou和Doudna, 2016;费尔曼等人，2017)。但是，有必要重申一些与这次审查有关的重要细节。所有的基因编辑方法，包括CRISPR/Cas9，都是基于细胞在DNA双链断裂(DSB)事件后修复基因组的固有能力(Chang et al.， 2017)。DNA修复在一定程度上依赖于非同源末端连接(NHEJ)机制，这是一种同源独立的易出错通路，以可变的百分比促进新生插入/缺失(inels)的出现。NHEJ可导致编码序列或调控区域的破坏，从而导致相关基因失活(NHEJ介导的敲除)。此外，可以利用NHEJ插入外源性DNA片段，如基因组中的reporter或drivers (NHEJ介导的knockin)。或者，DNA片段的敲入可以通过不同的DNA修复途径进行:同源定向修复(Homology directive repair, HDR)。该通路需要同源DNA模板的可用性，通过同源重组(homologous Recombination, HR)促进DNA修复。已经通过HDR (HDR介导的基因敲除)开发了几个应用程序，以实现对斑马鱼基因组的精确、程序化修改:引入点突变来模拟特定的人类snp，以及/或将LoxP位点集成到特定的位点重组或荧光报告基因中。然而，在斑马鱼等系统中，由于HR修复DSB的速度低于NHEJ, HDR仍是一个具有挑战性的方法(Maruyama et al.， 2015;Horii and Hatada, 2016)。另一种策略是使用改良的Cas9蛋白，这种蛋白不会分裂DNA，但允许产生SNP交换或调节转录。下面，我们将讨论所有这些方法，它们的挑战和潜在的生物医学应用，以发现新的人类治疗方法。

CRISPR / CAS9-Mediated淘汰赛

斑马鱼感兴趣的基因诱变可以通过一个相对简单的实验装置来实现。该方法显示出最高的诱变效率是基于微注射体外预组装复合物的指导RNA和Cas9蛋白在一个细胞阶段的胚胎。F0动物注射后有两种可能的策略。无论哪种情况，F0注入的携带嵌合功能缺失(LOF)突变(INDELs)的幼虫都可以直接表型化，并用于研究候选基因的功能，这种策略被称为瞬时敲除方法。或者，F0幼虫可以生长到性成熟，杂交产生F1杂合子载体和F2纯合子突变体幼虫，称为同基因稳定敲除。产生一个同基因稳定敲除需要6个月，并允许获得数百个F2幼虫

(纯合子、杂合子和野生型兄弟姐妹)，可以用来证明一个研究假设，或在一个强大的生物学背景下并行评估几种候选治疗药物。

瞬态淘汰赛

新一代测序技术的出现有助于识别越来越多可能与人类疾病有关的候选基因。为了处理这些大量的数据，一个高通量的策略来验证候选基因的表型将是非常有利的。在这条线上，一份报告显示，83个基因(162个位点)的诱变成功率为99%，种系平均传输率为28%。这也表明，通过近亲繁殖两个方正鱼，在F1代可以进行表型，从而显著减少畜牧业所需的时间和空间(Varshney et al.， 2015)。另一个针对48个基因组位点的高通量CRISPR-Cas9表型筛选出两个参与电突触形成的基因(Shah et al.， 2015)。由于体细胞突变的高效性，作者能够在注射F0的动物中检测到特定的表型。在最近的一份报告中，通过对Cas9和sgRNA riboprotein complex (RNPs)的体外组装优化，可以产生所谓的CRISPR (CRISPR/Cas9介导的突变体)，这种突变体在注射后可产生高比率(高达100%)的体细胞突变。事实上，本报告通过靶向F0注入的幼虫的几个基因组位点，并对纯合子同基因突变体中显示的LOF表型进行重述，

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