通过自组装FeII8L6立方体笼的序列选择性封装和长肽保护
原文作者：Jesu acute;s Mosquera,Bartosz Szyszko, Sarah K.Y. Ho amp; Jonathan R. Nitschke
摘要：自组装提供了制备大型空心高度对称结构的常用策略。虽然生物胶囊如病毒衣壳能够选择性识别复杂的化合物，但合成的胶囊缺乏选择性地结合大型复杂的生物分子的能力。在这里我们描述了从FeII和含锌卟啉的配体的自组装获得的立方主体笼。这个立方笼子结构多样并且与水相溶。其包封选择性由客体官能团与锌卟啉的配位驱动。这种新的主体能选择性的包裹包含咪唑和噻唑等客体分子，包括药物和肽。一旦被包封，肽的反应性被显着改变：包封的肽被保护免受胰蛋白酶水解，而未结合的物理化学相似的肽被切割。
关键词：立方笼子；咪唑；噻唑
引言
最近的许多研究已朝向新功能探索合成包封化合物1，2。限制可以稳定反应种类3，促进不寻常的反应4，调节催化剂活性5，6或报告传感器中存在的分析物7。这些功能主要利用长度小于1nm的客体进行探索8，很大程度上是因为制备大型宿主分子困难，这些分子能够有效地封闭与周围溶剂不同的物质。随着最近的改进分子自组装技术，这种局限性正在被克服9，10。
自主装合成的最大的包封化合物至今还未报道11-14。这种主客体结合的缺乏可以从以下方面来理解：主体的刚性结构能最大程度地使之与客体分子的接触;低度的腔体外壳，这导致了主客体之间的较低的交互次数;以及主体内缺乏互补部分，通过特定的相互作用来约束客体分子15，16。因此，尽管这种结合可以实现，但大型、信息丰富的生物分子如天然生物聚合物的直接结合尚未实现，特别是已经发现的许多治疗性肽和蛋白质中，由于其低生物利用度和对酶降解的敏感性，目前仅使用少数几种17，18。遵循先前在无菌和生物系统之间成功接口的例子，合成自组装胶囊可以通过改变肽的溶解度并保护它们免于裂解来减少这些限制19。 然而，迄今报道的这种分子包封的唯一例子涉及蛋白质与笼内共价、不可逆的附着、抑制释放或交换短肽20，21。
在这里，我们报告了大型卟啉面立方体笼 1 的制备和表征。它灵活地掺入卟啉锌（II）中心，使得包含咪唑基序的客体（包括含组氨酸的肽）的结构紧密。所述咪唑基序包括长度高达23个残基的含组氨酸的肽。包封后，客体肽被胰蛋白酶切割保护，而存在于相同溶液中的未包封的肽被快速切割。笼子 1 因此代表了能够结合大而复杂的生物分子客体的人造主体的第一个例子。
结果
笼子 1 的合成和表征。四（甲酰基吡啶）卟啉A（6当量），四氢萘胺B（24当量）和三氟甲磺酸铁（II）（8当量）在DMF和MeCN的4:1混合溶液中反应，得到的产物 1（图1a）。FeII8L6的结构通过电喷雾电离质谱法确定。没有成功培养出能测出单晶结构的 1 ，这可能是由于其复杂的结构导致的。因此，为了深入了解 1 的三维结构，我们准备了一个MM2能量最小化模型（图1b）。通过从卟啉离中心更近或更远的配置开始，能量最小化模型提供了介于3000和10000 Aring;3之间的体积估计，FeII.....FeII 沿立方体边缘的距离为20-22 Aring;。扩散-有序光谱核磁共振(DOSY NMR)分析提供了19.7 Aring;的水动力半径，在模型（补充图 57-59）的17-21 Aring;的范围内。因此，可用于客体结合的内部体积预计将强烈依赖于所采用的模拟结构。笼 1结合了大型腔体尺寸，高度的外壳和框架的灵活性，以我们预测的方式实现了比当前更大和更结构复杂的客体的封装，而不是在离散的非生物系统中22，23。
笼 1 在乙腈中稳定，在293 K空气中2个月后没有观察到降解。此外，核磁共振波谱显示 1 在水和乙腈1：1混合物中可溶且稳定，甚至在存在100当量的1-甲基咪唑（它是FeII的良好配体）的情况下也是如此。
主客体与小分子研究。 鉴于Zn-卟啉和已知咪唑类分子具有高的亲和力，我们关于 1 的客体结合性质的研究集中于含咪唑基团的客体分子。 我们使用1-甲基咪唑（G1）作为初始探针，在其通过1H NMR光谱结合之后。由于大的腔体，在加入G1之后，仅观察到1个b-吡咯型质子的信号的轻微高场位移。在乙腈，观察到7个当量的G1。然而，当使用1:1的水：乙腈混合物时，必须加70当量以达到饱和。我们推断在水存在下较弱的相互作用是由于水和咪唑之间的竞争氢键23,24。
为了量化亲和常数，将紫外-可见滴定用于随后的研究。G1的解离常数在乙腈中确定为30毫米和900毫米。这些结果与NMR实验的定性结果一致。接下来，我们研究了分子G2和G3的结合使用相同的紫外-可见协议。在乙腈中，随着与咪唑连接的芳香族部分的尺寸增大，亲合力略有增加。因此G3的亲和力比G1高6倍。然而这种效应在乙腈和水1：1时中更明显，其中G3的亲和力比G1高100倍以上。
为了进一步探测 1 的封装性能，制备了G4和G5。每一种都有两种咪唑片，由一种灵活的链接器连接，它可以与相邻或相反的锌卟啉相结合。G5含有萘二酰亚胺（NDI）部分，由于其大而平坦的芳香表面而倾向于堆叠，而G4中扭曲的中央链接器堆叠的趋势较小。因此G5在乙腈中比G4强结合近1倍（表1）。值得注意的是在1:1的乙腈：水中观察到的差异性增加了300倍以上。尽管G1这样的小型独居客体可能在1的内外表面上结合良好，但多个客体的长度将不足以让他们在立方体的外侧伸展以结合多个锌中心。 许多客体分子的较高结合常数表明它们包裹在 1 内25。G5的荧光实验也支持这一假设，其中加入 1 后观察到NDI准分子带; 如果在外部结合，则多个NDI组不能堆叠。尝试获得主客体复合物的有意义的扩散顺序光谱由于谱线变宽而不成功。
图1 | （a）由6当量引发的一锅合成程序。 卟啉A，24当量。 四氢萘胺B 8当量。三氟甲磺酸铁（II）制成立方体笼 1。为了清晰起见，立方体的仅一面以球 - 棒形式显示。 （b）三种不同MM2能量最小化模型的球棒表示，其空隙体积（以黄色显示）分别为10083,5600和3143 Aring; 3。（c）中为了清楚起见省略了苯胺残基的稠合环状部分。DMF，二甲基甲酰胺; OTf，三氟甲磺酸盐。
主客体与生物分子的研究。 在对含有配位基团的分子进行胶囊化的可能性进行初步调查之后，我们将注意力集中在以1:1的乙腈:水中包含这些基团的生物学相关的客体上。利托那韦（G6）是一种抗逆转录病毒药物用于治疗艾滋病毒。在 1 的溶液中加入G6使紫外可见光谱发生变化，类似于之前观察到的那些。推测与G5一样，G6获得104 mu;M的解离常数26。
以乙腈和水的比例1:1为原料，对含组氨酸多肽进行了进一步的结合研究。组氨酸是一种氨基酸，它的侧链中含有一种咪唑类化合物，它被纳入多种药理相关的多肽中。Clavanin A（G7）是一种这样的肽，是在海洋生物体的血细胞中表达的抗微生物剂Styela Clava。 这种药物被广泛用作肽抗生素27-29。
G7由23个氨基酸组成，其中四个是组氨酸，这促使我们研究其与笼 1 的相互作用。值得注意的是，使用2：1结合模型发现80 mu;M的解离常数，这表明每种肽都是被束缚的。还研究了类似的非生物学肽G8，以探测主客体相互作用的序列依赖性。G8具有三个组氨酸残基，比G7少一个，它们被与G7中相同数量的氨基酸分开。此外，G8也更具亲水性，仅含有7个疏水性残基，与G7中的12个不同。 观察到G8与G7结合的能力比G7低100倍，说明二次相互作用的重要性。相反，没有观察到组氨酸的肽，例如G9和G10，没有观察到与 1相互作用。选择这些肽的结合肽G6和G7/G8之间的中间长度，否则它们在物理化学上相似。在 1 存在下通过胰蛋白酶水解肽。最后，我们设想 1 的封闭立方体结构可以保护其含有组氨酸的肽客体免于酶促降解。对于这些实验，我们使用蛋白酶胰蛋白酶，其仅在赖氨酸和精氨酸残基的C端侧切割。我们最初考察了G7作为底物。但是，由于其在中性pH下的低溶解性和强烈的缺乏吸收发色团，我们无法通过高效液相色谱（HPLC）跟踪反应。因此，使用含有两种色氨酸发色团的G8代替G7。将20 mu;M的G8溶液与0.3当量的胰蛋白酶在乙腈和磷酸盐缓冲液（pH = 7.5）中混合30分钟，导致G8以76％产率裂解。相同的反应在0.6当量的存在下进行时， 1（2：1结合化学计量）的切割程度仅为9％。观察到的酶降解程度低
图2| 笼 1 在存在和不存在的情况下胰蛋白酶处理肽G8和G9。每个肽的切割产量显示在片段以下。 箭头指示肽被切割的位置。 Abz，2-氨基苯甲酸; Dnp，2,4-二硝基苯基。
与 1 和G8之间的9 mu;M解离常数一致，这意味着在反应条件下存在少量游离肽。
当用非结合的G9代替G8进行同样的实验时，有或没有 1 时，都观察到定量的G9切割。在进一步的测试中，我们用胰蛋白酶处理两种肽和1的混合物，并在相同条件下温育混合物。在这种情况下观察到很好的几乎没有的选择性。G8只发生11％的切割，而G9完全水解。重要的是，G9的水解不受游离A或水溶性Zn-卟啉的影响，表明与锌卟啉的简单相互作用不足以保护肽免于胰蛋白酶。
讨论
因此，我们第一次利用合成分子容器用于包封生物分子如多肽和药物。由于主体 1 的结构特征的独特组合，即大而封闭的腔体，组件的刚性和灵活性之间的平衡以及能够结合的卟啉锌（II）和咪唑基团。此外，该组装被证明能够特异性地保护含有组氨酸的肽免于酶促降解。因此，这项工作代表了让合成容器分子与生物分子的反应性接触并改变反应性的重要一步。今后在这类分子系统上的工作可能有助于开发有效的药物输送系统，或者允许受控制的生物分子系统在体内的功能调节。
方法
1 的制备。在J-Young 核磁管中，将卟啉A（4 mg，3.3 mmol，6当量），三氟甲磺酸铁（II）（400 mg）悬浮于 [D7] DMF（1.5mu;L，4.4 mmol，8当量）和5,6,7,8-四氢萘-2-胺B（1.9 mg，13 mmol，24当量）和 [D3] MeCN（100mu;L）。
通过三次冷冻泵-解冻循环使溶液脱氧，将管密封，并在70℃的油浴中加热8小时。 此后，将溶液打开至空气并冷却至室温。加入乙醚（3.5 mL）和氯仿（1.5 mL）的混合物，产生紫色固体沉淀。 离心悬浮液，除去固体上方的溶剂。 紫色固体用氯仿（3 mL）洗涤两次并在氮气下部分干燥。 用氮气干燥后，将固体溶于乙腈（0.5 mL）中。1 不溶于纯水，但它是可溶于1:1乙腈：水混合物（1 mg / mL）。
紫外可见吸收光谱。使用 Perkin Elmer Lambda 750 UV-Vis-NIR 分光光度计，用PTP-1Peltier温度控制器附件进行紫外可见吸收光谱测量。光谱仅在双光束模式下获得（前）分析物光束记录光谱，空气在（后）参考路径中。使用光程长度为1 mm的石英比色皿分析样品。 除非另有说明，否则417纳米是根据客体结合而选择的波长。
通过1H NMR研究主客体化学。在CD3CN：D2O（1：1）或纯CD3CN的混合物中制备 1（0.5 mL）的溶液并将其转移至J-Young核磁管30。将等分的客体加入相同的溶剂混合物中。 每次添加后记录N
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