乙烯响应因子SmERF6共调控SmCPS1和SmKSL1的转录，以及参与丹参毛状根中丹参酮酮的生物合成外文翻译资料

乙烯响应因子SmERF6共调控SmCPS1和SmKSL1的转录，以及参与丹参毛状根中丹参酮酮的生物合成

ZhenqingBai^1,2 WenruiLi^4,5 YanyanJia¹ ZhiyongYue⁶ JieJiao¹ WenliHuang¹ PengguoXia³ ZongsuoLiang^1,3

摘要SmERF6识别细胞核中SmCPS1和SmKSL1启动子的GCC-box，调控丹参酮在丹参毛状根中的生物合成。

丹参酮在丹参中是一种非常重要的药用成分，最著名的是它在医学上的应用。然而，这些转录因子是如何调节丹参酮的生物合成的尚不清楚。在这里，我们分离并确定了一种丹参ERF家族的转录因子SmERF6。这个转录因子是从丹参cDNA文库中的两种关键基因SmKSL1和SmCPS1的启动子筛选出来的，这个转录因子可以调节丹参酮的生物合成。这个基因在根中高表达，并可以响应乙烯处理。SmERF6调节丹参酮的生物合成靠直接结合启动子SmKSL1和SmCPS1中乙烯响应元件（GCC-box），启动它们的转录。在毛状根中过表达SmERF6可以提高丹参酮的积累。利用SmERF6RNAi沉默技术可以导致丹参酮含量降低。而且，丹参酮的积累可以维持丹参中酚酸和类黄铜的平衡。这些发现可以解释SmERF6是如何直接调节SmCPS1和SmKSL1的转录，以及调节丹参酮的合成来促进丹参的新陈代谢。

关键词：人工microRNA·ERF转录因子·GCC-box·SmCPS1·SmERF6·SmKSL1·丹参酮

前言

丹参酮一种典型的二萜，在丹参中是一种非常重要的药用成分。这是一种非常著名的医药，被用于治疗心血管疾病且在现代临床表现出较强的抗氧化活性。超过40种亲脂性二萜已经从丹参中分离确认，包括T-I, T-IIA, CT, and DT-I，阐明丹参酮生物合成途径的调节机制将为传统的中药应用丹参奠定基础。

丹参酮的合成通过两种直接途径：甲羟戊酸途径和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径。SmCPS1和SmKSL1被报道称是两种关键的在丹参酮生物合成的最后步骤中的基因。CPS1催化（E,E,E）-丹参牻牛儿基二磷酸产生二磷酸共聚脂（CPP），KSL1催化CPP形成，一种丹参酮的前体物质。但是有很少报道证明这两种关键基因的调控机制。乙烯转录因子家族包含一个AP₂DNA结合域。这些蛋白在植物中形成一个大的基因家族。在拟南芥中至少包含122个基因编码乙烯转录因子。乙烯转录因子通常被分为12个不同的组：从I到X,VI-L和Xb-L。大多数乙烯转录因子家族成员是植物特有的，在植物的生长发育及生物胁迫和非生物胁迫中起重要的调控作用。在拟南芥中过表达ERF019可以延缓植物的生长和衰老，并提高植物的抗旱性。ERF转录因子最近研究表明在植物的次级代谢中扮演非常重要的角色。在丹参中，有171个ERF家族成员，且某些成员在丹参酮的生物合成中有潜在的相关性。

在本次研究中，我们根据SmCPS1和SmKSL1启动子从丹参cDNA文库中分离得到了一种和AtERF6高度同源的ERF家族基因。从丹参中分离得到SmERF6转录因子，ERF6转录因子是一种激活转录因子在植物响应各种生物胁迫和非生物胁迫中起作用，例如氧化胁迫、高温、寒冷和生物胁迫。在拟南芥中MPK6–ERF6–ROSE7/GCC-box复合体调节氧化基因转录和氧化响应。可是SmERF6在植物的次级代谢和丹参酮的生物合成中的作用尚且不清楚。随后，SmERF6被发现在激活SmCPS1和SmKSL1的转录中起直接作用，SmCPS1和SmKSL1是丹参酮生物合成最后步骤的两种关键基因，且可以提高丹参酮的积累量。而且，有效转移SmERF6可以增强丹参酮的积累量。

1.1材料和方法

1.1.1植物材料和生长条件

实验室保存的丹参无菌苗，在含7%琼脂糖的Murashige和Skoog(MS)培养基(pH 5.8)上进行培养。丹参的毛状根来源于这些植株，感染发根农杆菌(ATCC15834株)，每30天进行一次继代培养。

为分析组织表达，收集了丹参幼苗开花时叶片、根、茎、花等五种组织类型。在这些组织中检测SmERF6的表达水平。

乙烯处理，18天的丹参毛状根在6,7-V液体介质(25°C,0.5 g)中震荡培养和最后以200mu;g / l乙烯利浓度处理。样品处理后分别于0、1、2、4、8、12、24、72 h及8天后采收。以无乙烯利处理的丹参毛状根为对照。所有收集的样本立即在minus;80°C液氮冷冻和储存。

1.1.2总RNA和DNA提取

采用RNAprep纯植物试剂盒(Tiangen, Yan-gling, China)从冷冻的丹参样品中分离总RNA。RNA反转录成cDNA，利用PrimeScripttrade;RT试剂盒与gDNA Eraser (TaKaRa,Dalian,China)。采用改进的十六烷基三甲基溴化铵法分离基因组DNA。

1.1.3定量RT - PCR (qRT - PCR)分析

采用SYBR Premix ExTaq (TaKaRa)对带有ABI PRISM 的96孔光学平板7500 Real-time PCR系统(Applied Biosystems)进行实时定量PCR。PCR热循环如下:95℃30s，95℃，5s，40循环和60℃，30s。并以SmActin基因为内源性对照。

1.1.4 SmCPS1和SmKSL1启动子的分析

我们利用基因组文库鉴定了SmCPS1的启动子序列(Xu et al.2016)。采用基因组步移法获SmKSL1启动子序列(Genome Walking Kit, Code No.6108,TaKaRa))。利用PLANTCARE和PLACE在线工具对该启动子的顺式作用元件进行了预测和分析。将启动子克隆到PCAMBIA0390载体中，在农杆菌EHA105介导的烟叶N. tabacum中表达，72 h后对其进行外源喷施乙烯利(600mg/l)。24小时后，GUS酶活性如前所述(Ramadan et al.2011)。SmCPS1(408,637,826和1075bp)和SmKSL1(200,471,649和876bp)启动子的活性位点是基于顺式作用元件SmCPS1和SmKSL1划分的。并利用pGL3系统如前所述的赵实验室(Gu et al.2013)进行确定了。将双向表达载体PGL3-SmCPS1 (PC408, PC637, PC826, PC1057)和PGL3-SmKSL1 (PK200, PK471, PK649, PK876)转化进N. tabacum原生质体，证实其活性和抑制活性。原质体转化方法如前所述(Guet.al.2013)。原生质体如前所述准备(Li 2011)。萤火虫荧光素酶(FLUC)和Renilla荧光素酶(RLUC)活性采用双荧光素酶(Promega)测定(Dubois et al2015)。用于SmCPS1和SmKSL1启动子扩增的引物、PCAM-BIA0390和PGL3载体如表S1所示。

1.1.5 Y1H的筛选和验证

将826 bp SmCPS1和649 bp SmKSL1启动子克隆到pBait-AbAi载体中。诱饵载体引物(pBait-AbAi-SmCPS1-826和pBait-AbAi-SmKSL1-649)见表S1。丹参的cDNA文库已经构建， Matchmakertrade; 酵母单杂交筛选系统已被使用(Clontech Laboratories, Inc., Cat. Nos. 630491,

630429,Dalian,China)。短梗霉素A(AbA)抑制PYC826和PYK649酵母菌株的基础表达(图S2c, d)。PGADT7-SmERF6载体引物如表S1所示。PGADT7-SmERF6通过与Y1H-pAbAi-SmCPS1-826 (PYC826)和Y1H-pAbAi-SmKSL1-649 (PYK649)酵母株的相互作用验证，这些酵母株在SD/-Leu/AbA中重组了SmCPS1和SmKSL1启动子。使用Matchmaker Insert Check PCR MixI对PYC826和PYK649菌株进行菌落PCR鉴定 (Clontech, Cat. No. 630496) (图.S2a, b)。该步骤和beta;-X gal染色在酵母拟定指南中有介绍(Clontech PT3024-1)。

1.1.6 SmERF6基因克隆及生物信息学分析

SmERF6的核苷酸和氨基酸序列均来源于丹参的在线信息资源(http://bi.sky.zstu.edu.cn/DsTRD / home)。SmERF6全长编码序列(CDS)扩增引物如表S1所示。检索到的序列用于SWISS-MODEL 网站服务器上的基因模型预测(https://www.swiss model .expas y.org/)。采用MEGA6中的邻接法对SmERF6与AtERF家族进行系统发育分析。氨基酸序列信息如表S2所示。通过使用DNAman 5.0版进行多重比对分析，研究了保守基序。采用在线软件(http://nls-mappe r.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mappe rform .cgi)对细胞核定位信号多肽进行预测，分值为5.0。氨基酸的理化性质由ExPASy服务器(http://web.expasy.org/compute_pi/)测定。

1.1.7 SmERF6的亚细胞定位

将SmERF6基因与PA70390-GFP载体中的绿色荧光蛋白(Green Protein, GFP)融合，得到本实验室可用的p70390 -GFP载体。用于构建载体的引物序列如表S3所示。将表达载体SmERF6A7-0390质粒转化农杆菌EHA105。农杆菌被培养在OD₆₀₀ 1.028℃后重新悬浮培养在注射溶液中[0.5 M Mes.(pH值5.7;Sigma, Cat. No. M8250, Yangling, China),100mM MgCl₂,和150mM AS] OD600asymp;0.8。样品在室温黑暗中孵育2小时以上。用无针注射器将细菌悬液混合物渗透到4周大的N. benthamiana植物的叶片中。共培养2天后，如前所述制备原生质体(Li 2011)。

1.1.8共聚焦激光扫描显微镜

采用尼康A1R倒置共焦显微镜进行共焦激光扫描显微镜观察。用488nm氩激光器激发GFP熔体，用505-530 nm带通发射滤波器检测GFP熔体。相比之下，4,6-二氨基二苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)被408 nm氩激光器激发，并在另一个激光通道中使用512-550 nm带通发射滤波器进行检测。最后用640 nm氩激光器激发叶绿素，用660-740 nm带通发射滤波器检测叶绿素。

1.1.9蛋白质的提取

将SmERF6的编码序列克隆到PMAL-2A载体(Novagen)中。表S3中列出了SmERF6-PMAL-2A载体的引物。蛋白质在大肠杆菌菌落中使用300mM异丙醇beta;-D-1-硫半乳糖诱导过表达12 h。细菌细胞用低度超高压连续流电池干扰器裂解细胞，11000 g，4℃，30分钟。收集上清液。麦芽糖结合蛋白(MBP)标记SmERF6上清液与MBPTrap HP亲和树脂结合。对MBP (malE)和SmERF6纯化蛋白进行SDS-PAGE分析，得到一条主条带，分子量约为42 kDa和63 kDa(图S3a)，为纯全长蛋白。

1.1.10免疫印迹分析

免疫印迹检测标记蛋白如前所述(Liu and Zhang 2004)。抗MBP-tag小鼠单克隆抗体购自中国杨凌Kwbio公司(CW0288S, 1:30 000稀释)。与AP偶联的山羊抗小鼠IgG也购自Kwbio公司(CW0110S, 1:30 000稀释)。最后，使用从Beyotime公司(中国上海)采购的BCIP/ NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(C3206)进行彩色显像。

1.1.11

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