吡哆胺与丙二醛的反应：抑制晚期脂氧化终产物形成的机理外文翻译资料

吡哆胺与丙二醛的反应：抑制晚期脂氧化终产物形成的机理

Z. Kang H. Li G. Li D. Yin(中华人民共和国， 湖南长沙，湖南师范大学生命科学学院老化生化实验室）

摘要：晚期糖基化终产物（AGEs）和先进的脂质氧化终产物（ALEs）与许多年龄相关的慢性疾病和蛋白质老化有关。最近的研究表明吡哆胺（PM）在各种生物系统中都是一种有效的AGEs / ALEs抑制剂。由于丙二醛（MDA）是脂质过氧化过程中形成ALEs的重要中间体，本研究的目的是确定PM是否能直接捕获MDA，从而防止ALEs的形成。 PM在生理条件下易与MDA反应。在6小时内，检测到由等摩尔PM MDA反应得到的1-吡哆醛基丙烯醛加合物。 1-氨基-3-亚氨基丙烯络合物和二氢吡啶 - 吡啶鎓络合物也在7天温育后被鉴定。 PM也极大地抑制了与牛血清白蛋白（BSA）的MDA反应诱导的脂褐素样荧光形成。我们的研究结果清楚地表明，PM通过在生理条件下直接捕获MDA来抑制ALE的形成，并且提供了PM在保护蛋白免受羰基胁迫的作用机制方面的见解。

关键词：晚期糖基化终产物（AGEs） 晚期脂氧化终产物（ALEs）羰基应激 吡哆胺（PM） 丙二醛（MDA）

引言

美拉德反应和晚期脂质过氧化反应可引起组织蛋白的生化改变并导致AGEs和ALEs的形成，这与糖尿病并发症，动脉粥样硬化，尿毒症，神经退行性疾病和正常的生理老化有关（Brownlee，1995; Colaco 和Harrington，1994; Thorpe和Baynes，1996; Miyata等，1999; Baynes和Thorpe，2000; Miyata等，2000）。 许多来自美拉德的反应性羰基中间体和脂质过氧化反应在形成AGEs和ALEs中起中间作用（Miyata等，2000; Yin，1995）。这些有毒的羰基化合物与蛋白质的氨基反应，导致各种化学修饰和交联，从而改变蛋白质的结构和功能。 最近出现了抑制羰基捕获化合物形成AGEs / ALEs的努力，作为抑制这些生物分子中这些年龄和疾病依赖性变化的治疗方法（Shapiro，1998）。

作为脂质过氧化最重要的中间体之一，MDA是一种反应性不饱和二羰基，可以很容易地结合并交联生物大分子，如结构和功能蛋白和核酸（Esterbauer等，1991）。大多数（如果不是全部的话）急性和慢性疾病，如糖尿病和阿尔茨海默病，都是由于血浆中MDA的浓度增加（Slatter等，2000; Markesberry，1995）。 MDA可以与蛋白质反应并形成烯胺和荧光吡啶产物：1-氨基-3-亚氨基丙烯，二氢吡啶和二氢吡啶 - 吡啶鎓络合物，暗示MDA形成脂褐素样荧光团（Esterbauer等，1991; Yin，1996 ）。已经证实MDA在细菌，小鼠和人肾细胞中具有致突变性，并且在大鼠中是致癌的（Niedernhofer等，2003）。 MDA与DNA碱基反应产生脱氧鸟苷，脱氧腺苷和脱氧胞苷的加合物（Wang等人，2004）。在这些研究中，通过MDA形成DNA-DNA交联被认为是最严重的DNA损伤形式之一。

PM最初被描述为AGEs形成后的Amadori抑制剂（Khalifah等，1999; Metz等，2003）。后来还发现在脂质过氧化反应期间抑制ALE的形成（Onorato等，2000）。进一步的研究也证明，PM可以捕获碳水化合物和脂质降解的活性羰基中间体，包括乙二醛，乙醇醛，甲基乙二醛，4-羟基-2-壬烯醛和1,4-二羰基（Voziyan等，2002; Nagaraj等，2002 ; Amarnath等，2004）。在链脲佐菌素（STZ） - 糖尿病大鼠中，PM也延缓包括肾病和视网膜病在内的糖尿病并发症的发展（Degenhardt等，2002; Stitt等，2002）。在高血糖（糖尿病大鼠）和血糖正常（Zucker obese大鼠; Alderson等人，2003）动物中，脂质现在都被认为是组织蛋白化学修饰的重要来源，并且PM作为AGEs / ALEs抑制剂，强烈干扰脂质过氧化损伤蛋白质。 PM也抑制皮肤胶原蛋白中N“ - （羧甲基）赖氨酸（CML）和N” - （羧乙基）赖氨酸（CEL）的形成，尽管CML和CEL可能来源于糖氧化或脂质过氧化反应（Degenhardt等， 2002）。

在本文中，我们证明PM在生理条件下易于与MDA反应并且保护蛋白免受MDA的修饰。

材料和方法

材料

PM.(HCl)₂购自Sigma Chem。 Co.（美国密苏里州圣路易斯）。 1,1,3,3-四甲氧基丙烷（TMP）购自Fluka Chemie AG（Buchs，Switzerland）。 牛血清白蛋白（BSA）来自Amresco（Solon，USA），所用的其他化学品购自Sangon（中国上海）。

MDA的制备

根据Kikugawa的方法（Kikugawa等，1980），在使用前立即通过水解1,1,3,3-四甲氧基丙烷（TMP）制备MDA储备溶液（10mM）。 简言之，将0.084ml（0.5mM）TMP与1.0ml 1.0N HCl混合，并在40℃下振荡约2.5min。 TMP水解后，用6N NaOH调节pH至7.4，最后用0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.4）将储备液稀释至50ml。 使用“εMDA = 31500，通过在267nm处的吸光度估计原液中的MDA浓度。

PM与MDA的反应

PM（5.0mM）与等摩尔的MDA（5.0mM）在0.2M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中于37℃温育。 加入叠氮化钠（0.02％，w / w）以防止细菌生长。 样品通过高效液相色谱法（HPLC）或液相色谱-质谱联用（LC / MS）分析。

MDA与PM的反应混合物的高效液相色谱法（HPLC）分析

使用具有996型光电二极管阵列检测器的Waters TM Alliance 2690HPLC系统在反相Vydac C18分析柱（250mmtimes;4.6mm，10mu;m）上进行HPLC分析。 流动相由溶液A（0.1％三氟乙酸水溶液）和溶液B（乙腈，100％）组成。 流速为0.7ml / min，洗脱梯度如下：0-3分钟，0％B; 3-10分钟，20％B; 10-45分钟，50％B.

PM和MDA的反应产物的液相色谱-质谱联用（LC / MS）分析

LC / MS实验在与电喷雾电离（ESI）源（LC / MS-ESI）接口的LC = MS-2010四极质谱仪上进行。正电喷雾电离模式一直是检测的选择。通过Thermo Hypersil-Keystone Hypurity C18（150mmtimes;2.1mm，5mu;m）分析柱在以下条件下进行分离：溶液A为0.2％乙酸水溶液，溶液B为100％甲醇，流速为0.2ml / min，洗脱梯度如下：0-2min，15％B; 2-6分钟，35％B; 6-10min，0％B.SPD-M10Avp二极管阵列检测器的波长设置在210-360nm的范围内。 ESI / MS来源设定如下：探针，CDL和阻断温度分别维持在250℃，250℃和200℃。对于探针，CDL，Q阵列1,2,3偏置，Q阵列射频和检测器，电压分别设置为4.5kV，-30V，25V，150V和1.5kV。雾化器气体的流量为4.5L / min。用于选择离子监测的离子通过从m / z = 50-700的正离子模式扫描来选择。

M对MDA修饰蛋白的影响

在存在或不存在不同浓度的PM（PM和MDA同时添加到反应系统中）的情况下，将BSA（10mg / ml）与MDA（1.0mM）在0.2M磷酸钠缓冲液pH7.4（含有0.02％叠氮化钠 ）在37℃下24小时。 加入等量的20％三氯乙酸（TCA），3000times;g离心3min，沉淀出修饰蛋白。 为了完全去除PM和荧光MDA聚合物，将沉淀用20％TCA洗涤3次并在离心后收集。 最后，将沉淀的蛋白重新溶于0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.4）中，并将浓度调节至5.0mg / ml。 在以395nm的激发波长和460nm的发射波长读取荧光之前，将样品稀释20倍。

结果与讨论

MDA PM反应的HPLC分析

PM的标准吸收光谱在中性pH下显示三个峰：219,251和325nm。 在酸性条件下，质子[H] 与吡啶鎓环的氮基团键合，在293nm处产生吸收峰（Brealey和Kasha，1955）。 将PM（5.0mM）与0.2M磷酸缓冲液（pH7.4）中的MDA（5.0mM）一起在37℃下温育6h后，通过HPLC在酸性pH下分析反应混合物; 通过在293nm处的吸光度检测产物。 如图1所示，该系统中PM的保留时间为6.3min，而MDA在293nm处没有吸收。 在PM和MDA反应中观察到新产物（产物1），保留时间为11.3min（图1A）。 紫外吸收光谱显示在酸性条件下277nm处的吸收最大值（图2）。

吡哆胺与丙二醛反应

吸光率（293nm）

分钟

吸光率（293nm）

分钟

图1 PM和MDA反应的HPLC分析。 PM（5.0mM）与0.2M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中的MDA（5.0mM）在37℃下温育。 A PM和MDA孵育6小时 B PM和MDA孵育7天

吸光值

波长（nm）

图2 PM和PM MDA产品的紫外吸收光谱。 使用996型光电二极管阵列检测器在HPLC分析过程中获得PM和PM MDA产物的UV吸收光谱

吸收个高度（%）

孵化时间（小时）

如图3所示 在PM和MDA反应过程中PM的减少和产物1形成的动力学（以百分比表示，基于PM的吸光度）。 在293nm处测量吸光度

图4 孵育6小时后，反应混合物的LC / MS分析。 A二极管阵列检测器色谱图; B总离子色谱图; C保留时间3.77分钟时对应于总离子色谱图的质谱图

吡哆胺与丙二醛反应

图5 孵育7天后，反应混合物的LC / MS分析。 A总离子色谱图; B m / z 373选择离子色谱图（产品2）; C m / z 223选择离子色谱图（产品1）; D m / z 517选择离子色谱图（产物3）

图6 确定PM MDA反应的产物结构。 产品1,2和3分别是1-吡哆胺基丙烯醛，1-氨基-3-亚氨基丙烯交联和二氢吡啶 - 吡啶鎓络合物

图7 PM对MDA对BSA化学修饰的保护作用 在存在或不存在不同浓度的PM（0.1mM，0.5mM，1.0mM和5.0mM）的0.2M磷酸钠缓冲液，pH7.4中，将BSA（10mg / ml）与MDA（1.0mM） 37℃24小时。 用三氯乙酸沉淀蛋白质并调节浓度至0.25mg / ml后，在ex = 395nm，em = 460nm处测量类脂褐素样荧光。 数据是平均值plusmn;s.d. 一式三份

当在相同条件下继续孵育7天时，观察到两种其他产物（图1B），保留时间分别为12.0分钟（产物2）和13.8分钟（产物3）。 产物2的UV吸收光谱在293和310nm显示最大值（图2）。 产品3的光谱更复杂，紫外吸收最大值为237,262,293和388nm（图2）。 还通过HPLC分析0-24小时期间PM和MDA的反应动力学。 如图3所示，在培养的最初6小时期间PM的量减少并且产物1增加。 对于PM消耗，反应进行约45分钟的半时间，并且产物1的产率在约6小时达到平衡。

通过LC / MS鉴定反应产物

采用LC / MS来鉴定反应产物。 当反应混合物温育高达6小时时，由二极管阵列检测器（DAD）检测的产物1（图4A）对应于总离子流色谱（TIC）中检测到的产物（图4B）分钟。 产物1的质谱显示四个主峰：m / z 223 [MP1 H] ，m / z245 [MP1 Na] ，m / z261 [MP1 K] 和m / z467 [2MP1 Na] （图4C）。

当反应混合物温育7天时，除了m / z 233外，还鉴定了两种新产物。另两种为m / z = 373 [MP2 H] 和517 [MP3 ]（图5）。

众所周知，MDA可与氨基酸和蛋白质反应形成一系列产物，包括烯胺，1-氨基-3-亚氨基丙烯和二氢吡啶衍生物（Esterbauer等，1991）。也已知蛋白质可以与MDA衍生的二氢吡啶 - 吡啶鎓结构交联（Itakura等，1996）。根据分子量，考虑到PM与氨基酸具有相同的可与MDA反应的伯氨基，提出产物1,2,3是MDA与PM的烯胺加合物，1-氨基-3亚氨基丙烯交联和二氢吡啶 - 吡啶鎓络合物（图6）。产品1,2,3中PM：MDA的比例分别为1：1,2：1,2：4。考虑到烯胺的UV吸收在水中约271-280nm处显示最大值（Kikugawa等，1981），约300nm的1-氨基-3-亚氨基丙烯（Itakura和Uchida，2001），二氢吡啶和二氢吡啶 - 吡啶鎓衍生物在约235,260和398nm处显示三个最大吸收峰（Itakura等; Kikugawa等），我们的产品与所报道的光谱非常匹配。

PM对蛋白质MDA修饰的影响

经常报道MDA与形成荧光产物的氨基化合物如二氢吡啶和二氢吡啶 - 吡啶鎓衍生物反应（Esterbauer等，1991; Itakura等; Chio和Tapple，1969）。 Slatter

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 7 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[281597]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word