HPLC-UV方法同时测定人血浆中的二甲双胍、氨氯地平、格列苯脲和阿托伐他汀的的浓度及其在蛋白结合中的应用外文翻译资料

HPLC-UV方法同时测定人血浆中的二甲双胍、氨氯地平、格列苯脲和阿托伐他汀的的浓度及其在蛋白结合中的应用

Pawan K. Porwal ^a, Gokul S. Talele ^b

摘要:

高效液相色谱法(HPLC)作为一种简单、灵敏、快速、经济的测定方法，已经被证实可用于同时评估人类血浆中两个规定的固定剂量组合：糖尿病（二甲双胍和格列苯脲）和高血压与血脂异常（氨氯地平和阿托伐他汀）。

HPLC法被用于测量超滤液中待测物浓度的活性，分离的最佳条件为固定相(150 mmtimes;4.6 mm,5.0mu;m)，流动相由0.1%磷酸(pH值3.0)和乙腈(ACN)组成，柱温箱温度梯度模式保持在30℃和洗脱监控紫外波长在227nm。利用蛋白质沉淀法提取人血浆中的待测物。在寒冷的10%三氯乙酸(TCA)和乙腈组成的溶液中，所有分析物的回收率均超过90%；最佳的校准范围分别为二甲双胍10-10,000 ng mL^-1，氨氯地平25-5000 ng mL^-1 ，格列苯脲50-10,000 ng mL^-1，阿托伐他汀10-5000 ng mL^-1。平均相对误差当权重为1/2时符合校准曲线。在最低定量限内重复进样6次，样品测定的准确度和精密度均在限度内。在利用这种方法定量测定超滤液中蛋白结合待测物的试验中，发现加入人类血清白蛋白后游离分数有四到五倍的飙升。进一步的释放分数高白蛋白结合药物增加将近一倍孵化时Gly-HSA HSA的比较。与HSA相比Gly-HSA，高蛋白结合率药物进一步孵化可使游离分数增加了近2倍。

关键词：二甲双胍；格列苯脲；氨氯地平；阿托伐他汀；HPLC-UV；蛋白结合；人类糖化血清白蛋白

1.引言

2型糖尿病(T2DM)会改变体内的一些代谢途径。除了在葡萄糖代谢改变,2型糖尿病患者更有可能伴随/次要并发症如不良心脏事件^[1],[2]高血压和血脂异常^[3]，这可能导致微血管和大血管并发症。

因心血管疾病死亡的患者中，患有2型糖尿病的死亡人数比那些不患糖尿病的多2-4倍。针对高血压和血脂调节异常的精确药物治疗，调节微血管和大血管，从而减少风险事件的发生和2型糖尿病患者的死亡率。

通过严格控制血压和设定目标使其低于非糖尿病患者的课题，已经被证明可以有效地降低糖尿病患者心血管事件的发生以及死亡率。在大多数情况下为了实现这些目标需要在不同的活性物中规定3-6个^[8-11]，主要是肾素-血管紧张素系统(RAS)抑制剂，包括血管紧张素2受体阻滞剂和/或血管紧张素转换酶抑制剂、钙通道阻滞剂和肾素抑制剂^[12]。

2型糖尿病的口服抗糖尿病(OAD)主要为二甲双胍单独或与第二代磺酰脲类药物(格列齐特，格列美脲，格列吡嗪和格列苯脲)组合使用^[13]，市面上可以得到的有二甲双胍与格列齐特，格列吡嗪或格列苯脲组合成的片剂。最近，除了二甲双胍与格列苯脲（优降糖）外^[15]，二甲双胍与磺酰脲类的几个固定剂量组合已经被印度政府禁止^[14]。虽然二甲双胍加格列美脲的组合与二甲双胍加优降糖相比可以更多地降低糖化血红蛋白和空腹血糖，但是后者相对其他的组合更加有效、方便且耐受好^[16]。现在有很多种方法被报道可以同时测定二甲双胍和格列苯脲，包括高效薄层色谱、液相色谱与紫外光谱的结合^[17]、质谱^[18]和串联色谱^[19]。对于许多同时患有糖尿病和心血管疾病的患者来说，针对完全不同的适应症的药物的复方制剂和/或固定剂量组合可以提供治疗的准确性^[20]。阿托伐他汀和氨氯地平的组合是治疗糖尿病伴高血压的一线用药^[21]，单药治疗或固定剂量组合阿托伐他汀和氨氯地平在这些患者的纤维蛋白溶解平衡以及血压的控制都产生了非常好的的疗效^[22]。

尽管二甲双胍没有与血清白蛋白结合(白蛋白结合lt; 5%)，但它能诱导血清白蛋白产生构象变化^[23]。二甲双胍能够浓度依赖地抑制糖化白蛋白的产生^[24]，并可以减少毒性二羟基和糖基化终末产物(AGEs)的生成^[25]。磺酰脲类药物可以与血清白蛋白广泛地结合，并且主要通过非离子活性物从各自的结合位点进行替换，可能会引起糖尿病患者产生严重的低血糖^[26]。克拉霉素已经被报道可以从蛋白质结合位点取代格列苯脲、格列吡嗪，从而增加药物的释放或游离分数^[27]。已经发现糖尿病患者糖化白蛋白升高^[28]。据报道，大约30%的血清白蛋白通过非酶化糖化还原糖或其活性降解产物白蛋白一级或二级胺组减少糖^[29,30]。血清白蛋白的糖基化是与时间有关的非酶化过程^[24]，它能够损害高蛋白结合率药物与蛋白的结合能力^[31]。在此背景下,本研究想评估氨氯地平阿托伐他汀对血清白蛋白结合的影响和二甲双胍和格列苯脲与糖化白蛋白结合的能力。选中的活性物在超滤滤液蛋白结合实验中，使用液相色谱测定方法与紫外检测进行定量的测定。按USFDA指导生物分析方法使用HPLC-UV方法进行验证^[32]。

2.实验部分

2.1. 化学试剂

苯磺酸氨氯地平标准品，格列苯脲标准品，阿托伐他汀钙标准品，盐酸雷尼替丁标准品和罗格列酮标准品均有托伦特研究中心(阿默达巴德，印度)赠送；盐酸二甲双胍，重组人血清白蛋白(rHSA)和人类糖化血清白蛋白(Gly-HSA)的标准品均购买自西格玛奥德里奇(印度班加罗尔)；分析/高效液相色谱级化学品和溶剂从兰伯西精细化工有限公司(印度德里)获得；离心过滤设备(截留分子量:10 kDa)购买自密理博(印度班加罗尔)。

2.2.色谱仪器和条件

高效液相色谱系统(株式会社，京都，日本)的组成部分有：推进装置-2089、四元泵溶剂发送模块、20mu;L手动微量进样器和UV - 2075智能紫外可见检测器。生物分析方法的统计计算使用兼容Windows的Graphpad PRISM 5.1版本(Graphpad软件有限公司，加州，美国)。

氨氯地平，格列苯脲和阿托伐他汀不溶于水，易溶于有机溶剂如甲醇(甲醇)，乙腈(ACN)，反之，二甲双胍的溶解条件与他们相反。通过不同手段对色谱条件进行了优化(使用不同的柱，不同的流动相和有机相)。早期色谱工作逐渐使用不同品牌的C8和C18柱作为固定相，pH在2.5-4.0的不同浓度的流动相，有机相(乙腈和/或甲醇)。流动相的流速在1.0-1.5mL min^-1，使用双光束紫外可见分光光度计(日本岛津公司1800年,日本)在400-200nm波长处扫描药物洗脱液。

不同的高效液相色谱方法开发和优化保留了二甲双胍 格列苯脲和氨氯地平 阿托伐他汀及所有活性物的组合。

得到了最佳分离条件为色谱柱：Waterrsquo;s Nova pack Phenyl(150mmtimes;4.6mm，5.0 mu;m)；流动相：由0.1%磷酸(pH值3.0)和乙腈(ACN)组成；柱温箱温度梯度模式保持在30℃；检测波长227nm。

所有测量的进样量均为20mu;L，样品在由水相：有机相按2：3的比例组成的稀释剂中溶解。在生物分析的发展过程中,稀释剂也会发生相应地改变。

2.3.标准品的制备与解决方案

每个分析物由稀释剂配成浓度为10mu;g mL^-1，雷尼替丁(IS-1)为亲水性分析物二甲双胍的内标物质，罗格列酮(IS-2)为亲脂性分析物氨氯地平、格列苯脲和阿托伐他汀的内标物质；待测溶液包括浓度为10mu;g mL^-1的二甲双胍、氨氯地平、格列苯脲和阿托伐他汀以及由各自原液制备的浓度为5mu;g mL^-1的雷尼替丁和罗格列酮。为进行优化，将20mu;L各个分析物的溶液注入色谱仪计算系统适用性参数、色谱图峰面积RSD、保留时间RSD、峰高在10%峰值的不对称系数以及分离度(n=6)。

2.4.样品制备和提取

首选的分离方法是蛋白沉淀法，因为它可以使提取步骤最简化。该方法尝试使用10%三氯乙酸(TCA)和ACN组合。它包括1份血浆，0.1份药物和0.05份包含所有分析物的稀释标准溶液(15 mu;L)，在1.5mL的微量离心管中加入含有内标物的血浆，使其增加至150mu;L。混合物涡流5分钟，静置2分钟，然后加入100mu;L冷的10%(w / v)三氯乙酸继续涡流2分钟。分析物微溶于溶液，因此，加入245 mu;L乙腈涡流5分钟后，在4℃15,000转没分的条件下离心分离10分钟。混合物稳定后冷却10分钟，然后充入完全干燥的氮气。样本在等体积的0.1%磷酸(pH值3.0)和乙腈(ACN)下涡流2分钟。大约可以收集到200 mu;L的上层清液和约20个样本可供注入高效液相色谱系统中。

2.5.生物分析方法

USFDA指定高效液相色谱为生物分析方法。

2.5.1.专属性

为证明方法的专属性，对6个不同组别的空白血浆、加入标准品的血浆样品以及加入规定药物的血浆进行分析。

通过比较6个空白血浆样本与样品（n=6）获得的平均峰值获得各种药品的定量限浓度（二甲双胍和阿托伐他汀为10mu;g mL^-1，氨氯地平为25mu;g mL^-1,格列苯脲为50mu;g mL^-1）。生成的色谱表明，样本中的其他组分对实验结果完全没有干扰。稀释的完整性和延续效应也证明了方法的专属性。

2.5.2.校准曲线

标准曲线中6天为一个周期，测量斜率、截距和相关系数。每次运行包括双控系统，系统适用性样本，空白样本（不含内标物），校准溶液（含有内标物的血浆样品）；校准曲线包括覆盖整个范围的6-8个无内标物质的样品（二甲双胍、格列苯脲和阿托伐他汀的定量限为10,000ng mL^-1，氨氯地平为5,000ng mL^-1）和3个不同浓度的品质控制样品（n = 6）。运行在连续的6天生成。每次运行开始从低到高对校准物进行分析，其他样品在运行过程中则会随机分布。使用峰面积比值和浓度计算标准曲线。

2.5.3.灵敏度

注入连续稀释的低浓度溶液和加入标准品后的人血浆获得色谱，使用信噪比法确定灵敏度(LLOQ)。

同样，将处理后的空白血浆注入色谱仪，最低检测浓度待测物的响应至少5倍于空白响应。

2.5.4. 精密度与准确度

由6天内获得的数据计算精密度和准确度，从标准曲线的高中低范围中选择3个浓度作为质量控制的样本。在6天的周期中，5个不同浓度加入标准物质(LLOQ， 低 、中、高浓度C和ULOQ)的血浆样品需要每天进行测量(n = 6)：二甲双胍的各浓度分别为10，100，500，500 and 10,000 mu;g mL^-1；氨氯地平的浓度为25，100，500，1000 and 5000mu;g mL^-1；格列苯脲的浓度为 50，100，500，5000 and 10,000mu;g mL^-1；阿托伐他汀的浓度为10，100，500，1000 and 10,000mu;g mL^-1。

精密度用变异系数表示（%CV），准确度用平均相对误差表示（%MRE）。质量控制样品的精密度和准确度的（%CV）le;15%，LLOQ时le;20%是可以接受的。

2.5.5.回收率

所有待测物的回收率通过比较处理过的LLOQ，ULOQ 和 3个QC浓度等5个不同浓度样品与相同浓度的未处理（或未加入血浆）样本的平均峰值响应（二甲双胍，氨氯地平，格列苯脲和阿托伐他汀与内标物质的峰面积比值）。通过对比处理后的样品与相同浓度未处理的参比溶液的平均峰面积计算活性物和它们各自的内标物的回收率。

2.5.6.稳定性研究

稳定性实验旨在测试样品在收集之后及分析过程中可能遇到的所有条件中的表现。评估下列情况下药物的稳定性：两个质量控制水平(LQC和HQC)，短期台式(在室温下为4 h,8 h,16和24 h)，冻结解冻(室温3周期;20 C)和长期(30、60和90天20 C)。观察待测物溶液在室温和冷藏条件下保存48h的稳定性。

2.6.体外蛋白结合研究

使用超滤模式进行蛋白结合研究^[33]。超滤技术是一种相对简单，稳健和快速定量测量与血浆蛋白结合物质的方法^[34]。现在用于定量分析重组人血白蛋白中二甲双胍，氨氯地平和格列苯脲-蛋白结合药物的浓度。所有的蛋白结合物研究都采用Amiconreg;超离心过滤设备(截留分子量:10 kDa)。将含有所有待测物的溶液加入到重组人血白蛋白中，使每一种药物的浓度在1-10mu;g/mL范

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