铁皮石斛叶中黄酮类化合物的提取工艺优化 及其对酪氨酸酶活性的抑制作用外文翻译资料

国际分析化学杂志

2019卷，论文ID 7849198，10页

https://doi.org/10.1155/2019/7849198

研究论文

铁皮石斛叶中黄酮类化合物的提取工艺优化 及其对酪氨酸酶活性的抑制作用

学术编辑：Neil D. Danielson

为了建立从铁皮石斛叶中提取黄酮类化合物的技术，开发了一种结合Plackett–Burman设计（PBD）、最陡峭上升设计和中央复合设计的方法来优化黄酮类化合物的提取。此外，体外测试了黄酮类化合物对酪氨酸酶活性的抑制作用。PBD结果表明，乙醇浓度和提取次数是关键因素。响应面法（RSM）表明，最佳提取条件为乙醇浓度78％，提取6次，提取时间2 h，固液比1:50。在这些条件下，总黄酮含量可达到35 mg/50 mL。在体外酪氨酸酶实验中，提取的总黄酮对酪氨酸酶活性的抑制作用优于beta;-熊果苷，对单酚酶和双酚酶的抑制率分别超过100％和70％。这些结果表明，RSM可以有效地改善石斛叶中总黄酮的提取，并且提取的黄酮类化合物具有在食品和化妆品行业中应用的前景。

1. 前言

黄酮类化合物是一类具有2-苯基蒽酮结构和C6-C3-C6作为基本碳骨架的化合物，通常与糖结合形成植物中的糖苷，而一小部分呈游离形式（苷元）^[1]。黄酮类化合物已被证明具有多种生物学活性，例如抗氧化、抗炎和抗凋亡活性^[2,3]。在保健食品行业，最近发现的大多数天然酪氨酸酶抑制剂都属于黄酮类，它们比某些合成的酪氨酸酶抑制剂更安全、更有效^[4]。酪氨酸酶抑制剂可通过抑制酪氨酸酶的作用和多种微生物的生长来减缓加工和储存过程中的食物褐变^[5]。黄酮类也可以用作增白剂以达到增白功效。黄酮类化合物是最强的酪氨酸酶抑制剂，已广泛用于食品和化妆品中。因此，有必要在天然黄酮类化合物中寻找新型有效的酪氨酸酶抑制剂^[6]。

根据生物学分类，铁皮石槲是兰科的多年生草本植物^[7]。医学史记录表明，这种草药可滋阴，增加体液生成，增强胃动力，降低血糖并延长寿命^[8]。铁皮石斛的茎是珍贵的中草药，可在全国范围内食用，在浙江和云南也分别将叶子和花朵用作食品。2018年，叶子和花朵被纳入《食品安全法》进行管理。随着铁皮石斛工业的不断发展，喜欢吃叶子和花朵的人数正在增加。我们的研究小组已经测试了铁皮石斛各个部位的功效，结果表明，铁皮石斛各个部位的化学成分相似；特别是叶片中的黄酮含量高于茎中的含量^[9]。还发现从铁皮石斛的叶子中提取的黄酮类化合物具有抗氧化和降压作用。此外，黄酮类化合物可能会抑制酪氨酸酶的作用^[10]，这意味着黄酮类化合物可以在食品和化妆品中用作酪氨酸酶抑制剂。但是，尚无一种普遍存在的黄柏叶中黄酮类成分的提取方法，提取率较低。

因此，设计单因素实验以提高铁皮石斛叶中总黄酮的提取率。根据结果，通过Plackett–Burman设计（PBD），最陡峭的上升设计和响应面方法进一步优化了提取过程。此外，在体外测定了黄酮类化合物对酪氨酸酶活性的抑制率。

2. 材料和方法

2.1 化合物、材料和试剂

铁皮石斛由浙江森宇实业有限公司（中国京华）提供。酪氨酸，beta;-熊果苷和L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）购自Source Leaf Biotechnology Co.，Ltd.（中国上海）。乙醇由华东制药有限公司（中国杭州）提供。酶标仪购自Molecular Devices（美国硅谷）。紫外分光光度计购自Shimadzu（日本京都）。上海景洪实验设备有限公司（中国上海）提供恒温培养箱，河南雨华仪器有限公司（中国河南）提供旋转蒸发仪。

2.2 含量测定

芦丁标准溶液的制备方法如下：准确称取约10 mg芦丁标准品，置于50 mL容量瓶中，用70％乙醇稀释至恒定体积，振摇，得到质量浓度为0.2 mg/mL芦丁标准溶液。

标准曲线的绘制如下：精确绘制1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0mL的芦丁标准溶液，并将其置于10 mL堵塞的测试容量瓶中。随后，将70％的乙醇添加至5ml。然后加入0.4 mL的5％NaNO₂溶液，放置6分钟。加入约0.4mL的10％Al（NO3）₃溶液，然后振摇6分钟，并加入4mL的4％NaOH溶液，放置15分钟。最后，将空白试剂作为参考以测量510nm处的吸光度。绘制标准曲线以获得线性回归芦丁标准曲线的方程式。

总黄酮的测定方法如下：准确地获得样品，并用与标准品相似的方法进行处理。然后将结果纳入标准^[11]。

2.3 实验设计

2.3.1 单因素试验

开展单因素实验以估计每个影响因素的最佳范围。乙醇浓度（35％–85％），提取次数（1-5），提取时间（0.5–2.5 h）和液体比率（1:10–1:60）对黄酮类化合物提取率的影响被调查了^[12,13]。黄酮类化合物的数量进行了评估和分析，以确定PBD的最佳参数。

2.3.2 PBD

评估了四种因素对总黄酮提取的影响（表1）。单因素实验的结果证实，所选的料液比水平为1:40和1:60，萃取时间为1.5和2.5h，萃取次数为3和5，乙醇浓度分别为70％和80％。设计专家设计了十二组实验条件V.8.0.6软件^[14,15]。

2.3.3 最陡上升设计

最陡上升设计确定了这些关键因素的最佳范围。通过分析对PBD结果的正面和负面影响，萃取浓度的步长和无效点以及萃取次数分别为70％，1.5，1和1（表2).这些值增加了实验的强度，并且接近了效果最好的区域^[15,16]。

2.3.4 中央复合设计（CCD）

根据最陡上升设计结果，最佳乙醇浓度为77.5％，提取次数为6次^[17,18]。两因素CCD，涉及中心点的五次重复（表3），是经过设计的。在本设计中，黄酮类化合物含量为响应值，并使用Design Expert V.8.0.6软件^[19]。

2.3.5 铁皮石斛中黄酮类成分的验证和分析

在由CCD实验确定的最佳提取条件下进行了三次平行实验。将所得值取平均值以获得最终结果。

2.4 酪氨酸酶抑制活性的测定

将获得的提取物浓缩至0.4 g/mL的粗药，以8000 r/min的速度离心30分钟，取上清，并通过ADS-17大孔树脂用50％的乙醇洗涤。将提取物浓缩至2、3、4、5和6 mg/mL，并以相同的浓度梯度浓缩beta;-熊果苷。

以L-酪氨酸和L-DOPA为底物，根据表4列的体积使用移液枪将四组反应液准确吸到96孔板中。在恒定的10分钟后，将酪氨酸酶以0.25 mg/mL的30 mu;L的浓度加入各组37℃恒温培养箱中的最高温度。通过酶标记仪测量反应10分钟，30分钟，1小时，2小时和4小时后在475nm处的A₀，A₁，A样品和A空白的吸光度。酪氨酸酶活性抑制率用下式计算^[20]：

抑制率（%）=[1-（A_样品-A_空白）/（A₀-A₁）]times;100%

2.5 统计分析

通过Design Expert.V.8.0.6软件分析了PBD，最陡上升设计和CCD的结果。通过SPSS 21.0通过ANOVA分析其他相关数据，认为在plt;0.05时显著，在plt;0.01时显著。

表1. PBD及其结果

表2. 最陡上升实验设计及其结果

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