土壤微生物驱动的碳矿化对磷有效性的响应和反馈外文翻译资料

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土壤微生物驱动的碳矿化对磷有效性的响应和反馈

作者：Zhongwang Jing , Ruirui Chen, Shiping Wei , Youzhi Feng, Jiabao Zhang , Xiangui Lin.

摘要：尽管目前我们有对土壤碳和氮的相互作用方面的了解，但对土壤微生物驱动的碳矿化对土壤有效P的响应和反馈还知之甚少。为了更好地理解这些相互作用，我们将长期足够的氮磷钾施肥土壤（速效磷：13.4毫克公斤^minus;1）和缺乏磷的氮钾施肥土壤（速效磷：0.96毫克公斤^minus;1）分别在添加和不添加葡萄糖的环境中培养。在培养期间检测用来表征碳矿化程度的二氧化碳排放量。用高通量测序、qPCR和微量热力学来评价土壤细菌群落结构、数量和代谢活动。与足够磷的土壤相比，缺乏P的土壤的基础呼吸显著降低了，但是添加葡萄糖的土壤的净矿化显著增高了，这可能是由土壤微生物较高的能源成本造成的。添加葡萄糖促进微生物生物量和活性，特别是在P缺乏的土壤中，这种改善保持至少70天。细菌群落组成的变化是由几个特定的分类群体的优势诱导的，这些群体均能溶解土壤中的磷。缺磷降低了外源活性碳保留在土壤中。将活性C添加到P缺乏的土壤中可能会通过池循环将P从相对不可用的土壤结合池转移到微生物生物量池。我们的研究结果显示，缺P对土壤C的保留有消极作用，而活性炭对耕地的P有效性有积极作用。

关键词：C矿化；磷的有效性；细菌群落；微生物生长的热力学；微生物活性

1. 引言

养分有效性通过改变地球生物化学过程来控制碳循环(Mackenzie et al., 2002)。这说明影响碳矿化的养分有效性机制对于预测碳转换对环境变化的反应是重要的(Townsend et al., 2011)。磷（P）是在大多数生化过程中起关键作用的必需营养素(Vitousek et al., 2010)。然而，对比关于碳氮相互作用的个人性理解，(Treseder, 2008;Fontaine et al., 2011; Chen et al., 2014)，只有有限的研究涉及陆地生态系统中的磷有效性和碳循环过程。这些仅有的研究，其关于有效磷对碳存储的影响结果是有分歧的，有积极的(Mo et al., 2008; Fang et al., 2007)，有消极的(Li et al.,2014)，或者微不足道的(Fisk et al., 2015)。

土壤C循环也对P有效性有影响。主要可用P源自土壤中的两个主要磷储量：矿物（无机）磷酸盐和有机磷酸盐。由原生矿物代表的矿物磷酸盐，如磷灰石，羟基磷灰石和铁和磷铝螯合物。而有机P主要以磷酸肌醇和磷酸酯的形式存在(Rodriacute;guez and Fraga, 1999)。无机磷酸盐可以通过有机酸，铁载体和有机螯合剂溶解。有机P可以通过分泌的磷酸酶或纤维素分解酶矿化 (Richardson and Simpson, 2011)。另外，土壤中输入外源有机物可能会加剧或延缓SOM分解，引起正或负的启动效应(Kuzyakov et al.,2000)。启动效应可能会影响微生物有机质矿化的养分利用率，特别是P(Nottingham et al., 2012)。因此，理解磷有效性和土壤碳的动态转换之间的相互关系和潜在机制对磷循环进入全球碳转换具有非常重要的意义(Reed et al., 2015)。

土壤可用磷和碳的动态变化之间的相互作用是受微生物功能控制的。作为主要的生活量池和驱动土壤碳和磷循环的主要代谢机器 (Falkowski et al., 2008)，微生物能够促进土壤碳的动态变化、影响土壤磷的有效性。有证据显示，缺乏磷会对土壤微生物的成长和活动产生消极影响(Cruz et al.,2008)，并且在缺乏磷的土壤中加入外源磷能够显著提高土壤微生物生物量(Liu et al., 2012)。土壤可用P对土壤微生物群落的结构和多样性也有很大的影响，例如，它可以通过改变的真菌和细菌的比例组合来改变微生物群落(Li et al., 2015)，还有丛生根菌的多样性和群落结构(Lin et al., 2012)。这种在土壤微生物群落中通过增强或抑制微生物生长和活性导致的变化必然会反馈到碳转换上，从而不可避免的影响磷有效性(Ramirez et al., 2012)。在碳矿化过程中研究磷有效性是怎样影响微生物群落的组成和活动的，各种磷状态下微生物群落组成和活动变化是怎样通过碳矿化表现出来是非常必要的。

缺磷在农业土壤中是常见的，特别是在中国北方黄淮海平原。黄淮海平原是中国最重要的农业地区之一，面积约35万平方公里(Cai and Qin, 2006)。这里典型的土壤是pH超过8.0、缺少可用P的钙质冲积土。一项超过20年的长期现场实验表明在这块地区土壤受到P限制，因为作物没有获得P从而对氮肥和钾肥没有反应(Huet al., 2009)。因此，在中国北方提高P可用性对提高土壤生产力和升级中低产农田具有重要意义。值得注意的是，在这种土壤中添加有机物增加了可利用的P但减少了总P的含量(Hu et al., 2009)。由于分解过程和有机碳的转换促进磷释放，从而提高磷的有效性，因此将有机磷的变化与碳的变化联系到一起(Kemanian et al.,2011)。土壤P循环在更多的C通过根系分泌物和新鲜碎屑添加到土壤中，并导致大气二氧化碳浓度升高的情况下会被加速，这已被实验证实(Deng et al., 2015)。因此，我们假设输入活性炭会通过增加土壤微生物生物量和改变微生物群落来提高P在农业土壤中的可利用性。

本研究考察了碳矿化在缺乏P和富含P的情况下与土壤微生物群落结构和微生物活性的联系，以及它们对土壤溶解P的反馈。本研究的目的是（1）在加入活性炭的情况下评估有效P对基础呼吸和净矿化的影响；（2）在矿化期间表征土壤细菌群落结构和活动，测试细菌群落的变化在缺磷和富磷情况下的不同；（3）测试在农业土壤中添加活性C是否可以提高P的可用性。从这项研究中获得的观点将有助于了解微生物群落如何通过利用碳来影响土壤有效磷。

1. 材料和方法
   1. 土壤

目前的实验包括富P和缺P土壤都是从位于中国河南省的长期进行田间施肥试验的封丘农业生态试验站（35000N，114240 E）收集而来。关于这个土壤的详细信息已经由Chen et al. (2011)描述过了。简而言之，这项研究成立于1989年，是在冬小麦（Triticum aestivum L.）和夏玉米（Zea maysL.）的轮作之下进行的。土壤被分类为潮土，是源自冲积的黄河沉积物，其为沙质壤土（69％砂，9％粘土，22％粉砂），持水量（WHC）为29％（w / w）。来自这片地区的施有氮磷钾肥料的土壤作为富磷土壤（NPK），施有氮钾肥料的土壤作为缺磷土壤（NK）。

2012年秋季，玉米收获后（实验的开始23年以来），从所有四个NK和NPK处理的地块中收集土壤。采用30厘米直径的取土器钻取九个深度为0-15厘米的土样。使用前，小心除去根和植物残渣。将土壤均质化、过2mm筛，并储存在4℃条件下。从四个NPK处理地区获得的土壤中经过均质化以准备用来进行培养实验，来自四个NK地块的土壤也是如此。土壤化学性质列于表1。

表1：在培养实验中使用的土壤的化学性质。

注意：C：P是土壤有机碳与总P的比值； C：N是土壤有机碳与总氮的比值； N：P是总N与总P的比率。

• 1. 实验设计

培养实验包括四个处理：NK处理的土壤加葡萄糖（NKG），不加葡萄糖的NK处理的土壤（NK），NPK处理的土壤加葡萄糖（NPKG）和不加葡萄糖的NPK处理的土壤（NPK）,每个处理有三个重复。

将50克土壤加入玻璃罐（250毫升，高10厘米），并在28℃的黑暗室中预培养3天。土壤水分调整至WHC的60％。加入葡萄糖，每个罐的剂量为每千克土中加500mg C。罐子放置在28℃的暗室并保持通风。 在培养期间通过补充蒸馏水使土壤水分保持在WHC的60％。在培养期间测量CO2排放量以估计C矿化。只有添加了葡萄糖的两个处理（NPKG和NKG）有微生物活动。在加入葡萄糖前准备多余的瓶子和破坏性土样（零时刻），加入葡萄糖2天后（第二天），加入葡萄糖70天后（第七十天）进行培养。分析土壤速效磷、细菌数量，群落结构与活动。通过用0.5 M碳酸氢钠浸提0.5小时来测量土壤速效磷，其次是钼蓝法。

• 1. 二氧化碳排放

在培养的前两天，每隔6个小时收集一次NKG和NPKG处理的培养瓶中的气体，然后在第3、4、9、18、40天分别再收集一次气体。在培养第1、2、6、8、40、53、77天分别收集NK和NPK处理的培养瓶中的气体。取样前，将罐子冲洗10分钟，并将气密盖安装在每个罐上。气体样本是使用气密注射器密封后0和2小时收集。

通过气相色谱仪（Agilent 7890A，安捷伦科技）来分析CO2。首先通过改装的注射器引入样品，然后用填充13XMS（60/80 mesh，Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MS）的2米不锈钢分离柱（内径2mm）对样品进行分离。操作栏度设定在55℃，检测器温度设定在250℃。

根据CO2浓度的差异计算在封闭室顶部空间中密封时间下的CO2通量。在监测期内从二氧化碳通量线性插值计算二氧化碳累积排放量，用每kg土壤多少mg C来表示。通过差异方法计算添加葡萄糖的净C矿化，即葡萄糖和无葡萄糖的土壤累积排放CO2之间的差异。

葡萄糖-C的保留（GCR）被定义为比例加入到土壤中的葡萄糖。GCR是在第70天用方程（1）计算出来的。

NCE_70d：第70天净葡萄糖碳排放量; TC：加入的葡萄糖C总数（500 mg C kg^-1 soil）。

• 1. qPCR和16S rRNA基因的高通量测序

对第0、第2和第70天培养的土壤进行实时定量PCR（qPCR）和16S rRNA基因的高通量测序。我们用前者来代表土壤细菌数量（或更具体地说，相关细菌数量），后者表现细菌种类的相对丰度和群落结构。利用Fast DNA SPIN Kit for soil (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)提取0.5g土壤中的基因组DNA。提取的DNA溶解在50毫升TE缓冲液中，储存在20 ℃，直到进一步使用。

用SYBR预混料extaqtm试剂盒（Takara公司，大连）进行实时定量PCR反应。细菌数量利用引物集519F/907R测定。20微升反应混合物中，SYBR基质10微升，引物（0.2微升），1微升模板DNA。定量靶基因的拷贝数通过qPCR与C1000TM热循环仪配备CFTM实时系统（Bio-Rad）分析定量。单个克隆包含在LuriaeBertani培养基中生长正确的插入片段和质粒DNA ，然后提取，纯化和定量。将质粒DNA进行10倍系列的稀释以产生一个涵盖六个数量级的标准曲线，每个测定都有从10³到10¹¹的模板拷贝。空白对照一直是水而不是DNA提取物。最终的16S rRNA基因数量通过校准从土壤中提取的总DNA浓度获得。

用Illumina Miseq测序平台（Illumina Inc.）进行高通量测序。利用引物组519F / 907R的PCR扩增对细菌进行培养。寡核苷酸的5-bp序列融合到正向引物。PCR扩增在含有浓度为1.25mu;M的脱氧核苷三磷酸盐、2mu;L（15mu;M）的正向和反向引物和2U的Taq DNA聚合酶的50mu;L的混合物中进行。每个反应混合物获得1mu;L（50 ng）的基因组库DNA模板。PCR反应在以下程序下进行：94℃5分钟，30个循环（94℃60秒，55℃60秒，72℃75秒），最后在72℃延伸10分钟。用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）将反应产物汇集并纯化，并用NanoDrop ND-1000（Thermo Scientific）量化。等摩尔量的所有样品的序列PCR产物在测序前回归常态。

测序完成后，使用定量分析微生物生态学（QIIME）数据集管道（Caporaso et al。，2010）处理16S rRNA基因（V4-V5高可变区细菌16S rRNA基因）数据。质量分数低于25，长度小于200bp的序列被修剪，然后根据独特的序列分配给土壤样品。使用97％同一性阈值将序列分组到OTU中，并且选择来自每个OTU的最丰富的序列作为其代表序列。参考SILVA 119的一个子集，将分类法分配给OTU数据库（http://www.arb-silva.de/download/archive/qiime/）。主成分分析（PCA）是基于子水平的OUT表进行的。

辛普森指数由方程（2）计算：

D_s辛普森指数;n:子水平的总种数;P_i：“i”种的相对丰度。

• 1. 底物诱导放热的热力学

使用热活性监测器在第0天和第70天分析土壤中底物诱导的能量释放的动力学。在取样土壤后，立即将1克土加入到4毫升玻璃细颈瓶中。加入含有1.25mg葡萄糖的混合物作为底物。然后将细颈瓶放入28℃的TAM III（TA Instruments，Utah，USA）中。连续监测热流，并记录来自异常代谢反应的功率 - 时间曲线。

来自功率 - 时间曲线的热力学参数用于评估微生物代谢活动(Barros et al.,

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