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Received: 1 November 2012 /Accepted: 13 December 2012 / Published online: 30 December 2012 # Springer Science Business Media New York 2012

来源于海洋微生物的药物发现

作者：William H. Gerwick amp; Amanda M. Fenner

摘要：过去50年中，已经从海洋环境中发现20000多种inspirational天然产品。 其中就包括9个核准的药物和12个目前的临床试验药物，无论是作为天然产物或作为从天然中获得灵感的分子产品结构。在很大程度上，这些主要来自生活在浅水热带生态系统的海洋无脊椎动物。然而，呼声越来越高的是海洋无脊椎动物常常有大量的“相关”或共生微生物，而微生物是这些最有价值的海洋天然产物的真正代谢来源。此外，由于该领域内在的多学科性质，高度的创新是海洋天然产物药物发现努力的特征。

介绍

海洋天然产物化学领域是一个年轻的学科领域，仅从20世纪60年代开始，并在20世纪80年代发现的药物成为焦点。 最初的研究主要集中在最显眼和可收集的生物体上，即潮间带和浅水下潮间带藻类和无脊椎动物。 随着SCUBA的问世，以及随后将深海潜水器应用于此追求，越来越深的水生生物已被收集并筛选出其具有生物医学意义的次生代谢产物。 从这些努力中，超过22,000个离散海洋代谢物已经被分离出来并在结构上进行了表征，并且已经评估了相当大比例的生物活性水平，例如抗微生物作用或哺乳动物细胞毒性。但是，生物测定的范围非常巨大，以至于准确性不够足，并且产生了以下的说法——这个研究领域此时只是“捡到了软柿子”，许多令人兴奋的发现等待着对这些已知化合物以及还有待发现的那些化合物进行更全面的生物学评估。

这个观点的焦点是分享围绕海洋寻求新药物的目标以及验证这一追求的一些成功案例，并提出一些即将出现的未来研究领域。尽管对该领域以及已开发的成功产品普遍成功，但大多数关于海洋天然产物药物发现的研究都发生在公共部门，因为私营部门的变化已经改变了对这些“高风险”活动的热情。但表征海洋天然产物药物发现是否准确？努力为高风险？也许，但这是一个视角问题。例如，在某些方面需要遇到和评估的海洋化学实体的有用性质，然后得到批准的药物的数量比其他来源的要少得多。人们普遍认为，它需要对15,000种传统来源的化合物进行评估，以将单一药剂推向临床^[2];然而，从海洋环境来看，有9种已批准的药物，其中每2,500种特征天然产物大致转化为一种药物实体，比其他来源提高六倍。

查询已进入诊所的那些化合物，作为天然产物或作为类似物，以及它们所来源的生物体的类型，是非常感兴趣的。同时，人们越来越认识到，最初从大型生物体中收集到的生物质如海绵，被囊动物，分支软体动物等中发现的许多化合物实际上是由共生或相关的微生物产生的，或者源自原核微生物的饮食。事实上，在一些情况下，实验或间接证据支持这一结论。图1a提供了当今诊所海洋天然产物或当前或最近的临床试验的饼图他们收集的来源。显然，海洋无脊椎动物的确提供了大部分（21个中的18个，86％）。然而，图1b中给出了这些相同化合物的已证明或假设生物合成来源的统计数字，并清楚地表明海洋微生物的代谢过程确实是新型海洋药物的宝库。

图1 海洋天然产物成功案例选择

发现ecteinascidin作为一种强大的新型抗肿瘤药物的历史很长，涉及许多不同的实验室。 加利福尼亚海绵状囊虫Ecteinascidia turbinata的提取物首先由医师M. Sigel 研究，其癌症治疗特性被检测为体内活性。然而，活性化合物的数量及其化学复杂性使其化学结构20世纪70年代难以处理。 随后，当时的港口分支海洋研究所的Amy Wright和伊利诺伊大学的Ken Rinehart两个实验室几乎同时解决了活性代谢产物ecteinascidin-743的结构。 当时，这是迄今为止用光谱手段确定的最复杂的生物碱结构之一，并且是相当大的成就（图2）。

图2活性代谢产物ecteinascidin-743的结构

该药物由西班牙PharmaMar公司开发，最初在建立商业供应方面存在重大问题^[8]。生产的被膜的天然库存不足以提供可靠的供应，海水或海水池塘中的水产养殖和化学合成的总成本都太昂贵^[9]。最终，代谢物的一部分，即cyanosafracin B，可以从陆地来源的微生物荧光假单胞菌的发酵中获得，并且这被合成地修饰成ecteinascidin-743 ^[10]。这相关的生物碱

微生物代谢的已知产物是微生物可能是艾可特耐思菌素的最终来源的第一条线索，但这很难通过实验方法建立。最近，宏基因组学方法分离生物合成基因簇以产生ecteinascidin，成功表征了负责产生所需的25种生物合成酶的35-kb DNA序列。这些酶中的一些的异源表达有助于证实这确实是正确的生物合成基因簇，序列分析确定了未培养的共生细菌Endoecteinascidia frumentensis为最终这些基因的代谢来源。 Yondelisreg;是ecteinascidin-743的药物名称，于2007年在欧洲被批准用于治疗软组织肉瘤，并针对卵巢癌，前列腺癌和乳腺癌等其他癌症类型进行试验进展。

将多拉司他汀10类似物开发成有用的抗肿瘤药物

1987年，当时在亚利桑那州立大学的鲍勃佩蒂特报道了为期数年的努力来表征一个非常小的但是细胞毒性很高的产品的结果海兔Dolabella auricularia ^[13]。发现称为多拉司他汀10的细胞毒素是具有许多新特征的线性非核糖体肽合成酶 - 聚酮化合物合成酶杂合天然产物，包括甲氧基抑制素残基，由N，N-二甲基缬氨酸和羧基末端组成的氨基末端，一个噻唑环（图2）。多拉司他汀10凭借其抗微管蛋白作用机制显示出非凡的抗增殖特性，并且是揭示微管蛋白上的药物结合位点与长春花生物碱重叠的几种化合物之一^[14]。基于来自海兔的多拉司他汀10的低产率及其与其他蓝藻天然产物的结构相似性，早期提出该代谢物可能源自丝状海洋蓝藻中的代谢途径，后者是通过放牧吸收这些饮食衍生的天然产物的海兔饲养的。几年后，在R.E.摩尔实验室通过隔离密切相关的symplostatins证实了这一怀疑，随后证实了这一怀疑海兔毒素10本身直接来自海洋蓝藻Symploca sp。

在许多临床试验中评估了多拉司他汀10及其相关类似物的抗增殖特性，但是在所有情况下被发现毒性过大，引起周围神经病，并且在治疗癌症方面缺乏效力。然而，在2010年，尝试了一种不同的方法，即将多拉司他汀10（实际上，使用近似的类似物奥里斯他汀PE）附着于单克隆抗体，该单克隆抗体将靶向将该弹头分子直接递送至展现合适癌细胞的肿瘤细胞表位。而且，通过在药物之间连接可切割的接头和靶向抗体，观察到更高水平的功效。这可能是因为一些药物在细胞表面释放并作为活性物质扩散到细胞中，或者整个缀合物被内吞并在内体中切割成活性药物或同系物。在任何一种情况下，活性分子都会发现其微管蛋白靶标并产生强大的细胞毒效应。迄今为止，该缀合药物brentuximab vendotin作为Ascentrisreg;销售并且已被批准用于治疗间变性大细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

发现海绵细胞毒素的漫长道路到有用的药物Halavenreg;

海洋天然产物药物发现的里程碑成果列表当然必须包括植村实验室的惊人工作，首先描述从日本海海绵Halichondria okadai中分离出来的海绵蛋白（图2）。这些非常复杂的结构也是已知的最有效的癌细胞细胞毒素中的一些，并且还通过抗微管蛋白机制起作用。供应短缺削弱了他们的近期发展，但随后部分满足了这种需求，发现新西兰深海海绵中含有该系列中的先导化合物halichondrin B ^[19]。后者来源于图2海洋天然产物的评估和/或其临床有用的衍生物802 W. H. Gerwick，美国A. M. Fenner国家癌症研究所，并且对这种结构复杂但具有生物学价值的天然产物激起了高度的热情。全面化学合成努力哈佛的Kishi实验室发现，大约只有一半的分子是活性所需的^[20]，这有助于产生Eisai，Inc。的工业努力。最终，发现通过替代海兔软脑B片段的活性与简单的酮形成不稳定的酯键，从而稳定分子并提高其效力。对于I期临床试验，开发了这种衍生物的商业合成，称为eribulin，需要67个独立的合成步骤;显然，这种药物是由迄今为止开发的最复杂的工艺生产的，用于可靠供应药物分子！尽管如此，这种药物，以海洛因出售，对多种肿瘤类型尤其是乳腺癌显示出良好的疗效。

还没有发生关于软海草素B的生物合成和代谢起源的具体研究;然而，相对确定的是微生物负责生产这种精心制作的天然产品。该分子的总体结构是通过PKS途径对其生物合成进行诊断的。来自醋酸酯单元聚合的长直链碳链用残余氧化剂装饰，主要发生在乙酸的预测的C-1（羰基）位点上，并且在C-2位上的甲基基团来源于SAM甲基化或在这些位点掺入丙酸酯位置。 C-2碳氧化的替代位点预计将由P-450氧化引入，而C-1碳上的甲基化是涉及HMG-CoA合酶样反应的beta;-分支反应的特征^[23]。这些基本途径和独特的修饰是微生物代谢的标志，因此，可以肯定的是，海绵蛋白来源于海绵相关或共生微生物。

Salinosporamide A，多发性骨髓瘤临床试剂

临床使用的微生物海洋天然产品的最后一个例子是salinosporamide A，它已经在最近的临床试验中单独使用，并与其他药物联合用于癌症适应症^[24]。而在以前的情况下，与大型生物体结合或被捕食的微生物是生物活性天然产物的代谢来源，在这种情况下，它是一种养殖的海洋微生物。来源有机体属于最近描述的和专门称为Salinispora的链霉菌细菌属，其中三种被识别并且全部栖息于海洋沉积物中。发现S. tropica的发酵培养物产生强大的癌细胞毒素，其被定义为称为盐皮质mide胺A的独特beta;内酯（图2）。由于这种结构与另一种微生物代谢物即omuralide的结构非常相似，因此推断它具有相似的作用机制，即通过共价修饰活性位点苏氨酸残基抑制20S蛋白酶体。事实上，通过X射线晶体学证明了这一点，并且还揭示了侧链氯原子通过二级四氢呋喃环形成在药物的机理中起作用，这反过来阻止了水的进入并稳定与酶的新酯键^[25]。蛋白酶体抑制剂，例如目前批准的硼替佐米（商品名称），在治疗多发性骨髓瘤方面表现出特别的实用性，因此，圣地亚哥公司Nereus制药公司已将Salinosporamide推进至用于该适应症的II期临床试验

未来展望

正如图1所示，现有证据表明，生物活性海洋天然产物的真实财富在于海洋微生物的代谢能力。由于这种日益增长的认识，一些海洋天然产物发现计划已经开始关注海洋微生物学。亚太地区的专业化正在发生，各种研究人员正在研究海洋沉积物，海水本身，各类海洋无脊椎动物和脊椎动物，海洋藻类相关包括内生真菌在内的微生物和其他特殊的生态位。然而，鉴于其独特的营养和生理需求，以及在某些情况下低细胞密度下的生长^[26]，有效培养这些生物体需要新的方法。或者，目前正在开发独立于培养物的方法，其中可以使用宏基因组的信息学分析来鉴定独特的次级代谢物基因簇，并且随后可以合成这些基因并将其引入表达宿主^[27]。虽然原则上是一种通用的解决方案，但在很多示范案例中难以制定，对途径及其操作的技术知识仍然不完整，需要进一步的研究。

很明显，迄今为止在海洋天然产物化学方面的努力主要集中在最容易收集的那些生物体的主要代谢物上，并且尽管近来已经转向微生物，如上所述，少量存在的次要代谢物是这对分析和生物学评估来说是一个挑战。然而，各个部门正在取得技术进步，以改善获得次要代谢产物的机会，例如日益广泛使用核磁共振微冷冻和毛细管流量探针，体积越来越小的生物学检测，如384-和1,534-孔板中的电极，可能是最有力的方法改进，以及与质谱相关的信息学。在后一方面，最近已经应用了一种称为分子网络的非常强大的技术来构建给定生物体的次级代谢组的全局观点（图3）^[28]。该方法给出基本上相同的重量或能够显现次要代谢物以及主要代谢物，并且还提供了与添加到数据集中的提取物或化合物库中的其他代谢物的结构相关性的即时指示，以便提供关键的参考点。随着该方法得到更好的认可，其实用性肯定会扩展到自然产品调查的许多其他方面，但这种方法已经对（a）检测和识别（b）检测和识别与任何已知化合物无关的基本新分子多样性，（c）鉴定能够深入了解生物合成过程的共代谢物和（d）在改变的生长或诱导条件下新表达的代谢物。

图3生物体的次级代谢组的分子网络

我们可以预测海洋天然产物药物发现计划中戏剧性改善的第三个领域是提取物，馏分和纯

化合物的生物测定。与海洋天然产物的分子多样性一样，生物测定空间当然也是如此大，甚至更大。从酶到受体到DNA或RNA等一系列生物学靶点，其中一些在不同程度上相互协调一致，一些在活性位点，而另一些位于变构位点，组合在一起形成了惊人的潜在生物活性范围。因此，看到使用评估表型筛选的趋势已经很有趣相当广泛地是测试材料以期望的方式改变细胞表型的能力，尤其是那些以高含量评估方法运行的细胞表型^[29]。此外，在涉及细胞系统的测定形式中，还可以深入了解痣细胞的药效学性质，如细胞外显和稳定性。当然，表型检测方法留下了生化机制的问题，但同样有增长的迹象为确定新的生物活性化合物的机制或靶点提供了许多有力的方法和方法，所以这不应该是一个主要的障碍

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