海水柱和沉积物中氨氧化古细菌的普遍性和多样性外文翻译资料

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海水柱和沉积物中氨氧化古细菌的普遍性和多样性

地质和环境科学与土木与环境工程，斯坦福大学，斯坦福，加州 , 94305；

微生物学系，华盛顿大学，西雅图，98195

联络主编：Pamela A. Matson，斯坦福大学，斯坦福大学，CA，2005年8月5日

摘要：硝化，即氨的微生物氧化成亚硝酸盐和硝酸盐的过程，发生于各种各样的环境并在全球氮循环中发挥着重要的作用。通过酶氨单加氧酶的催化，氧化氨的作用曾被认为仅限于和菌组内。然而，最近的宏基因组研究揭示了独特的氨单加氧酶亚基（amoA）的存在。这种基因来源于未培养的非极端泉古菌。在这里，我们提供了在河水柱和沉积物中广泛存在氨氧化古菌（AOA）的分子证据。利用针对古amoA 的PCR指示试剂，我们发现AOA遍布于对全球氮循环至关重要的海洋区域，包括透光层的底部，低氧水体以及河口海岸沉积物。多样和独特的AOA群与这些栖息地的特性息息相关，例如这些栖息地中几乎没有水柱和沉积物之间的重叠。 在海洋沉积物中，大多数AOA序列是独特的个别抽样位点，而少数序列则明显地具有国际化（一致性）的分布。考虑到非极端古细菌在海洋中的丰度，我们的结果表明AOA可能全球氮循环中在发挥着相当重要，但以前不曾发现的作用。

关键词：泉古菌；硝化；氨单加氧酶

氮（N）是海洋中必不可少并限制大多数海洋生态系统的生物生产力的营养元素。在全球范围内，生物固氮是海洋中氮的最大来源，而厌氧微生物过程是造成氮损失的主要原因。然而，生物固氮和厌氧损失最终通过由微生物介导的，从铵盐经过亚硝酸盐两步转化为硝酸盐的硝化过程连接。每年海洋中的氮循环多达 kg，而且几乎所有这些氮都必须被硝化一次以上。尽管硝化过程在整个海洋中很重要，但它在沿海地区起着更为关键的作用，因为它将含氮有机物的分解与氮的损失通过反硝化作用（即硝酸盐到氮气的微生物转化过程）联系了起来。通过在到达开阔海洋之前，在河口和大陆架区域消除大部分的人为氮污染，耦合硝化/反硝化能够有效地将海洋氮循环从已经发生剧烈变化的陆地氮循环中分离出来。在开阔海洋中，30-50％的氮损失发生在少氧区（OMZ）的中上层，其中大量的氮损失归因于最近提出的厌氧铵氧化（anammox）。在厌氧铵氧化过程中，铵盐通过消耗在硝化过程第一步中产生的、由异养硝酸盐还原或好氧氨氧化的亚硝酸盐进行氧化。因此，硝化是在少氧区和沿海沉积物中的氧/缺氧界面处特别重要的过程，其中氮化，脱氮和厌氧氨之间的复杂相互作用驱使着快速的氮转化以及大量氮流向大气。已知只有少数的系统发育受限的微生物组能够进行硝化过程中的两个步骤中的任一步骤（从铵盐到亚硝酸盐、再到硝酸盐的转化），而所有这些微生物组都是结构域细菌的成员。由于它们能够催化硝化过程中的第一步骤和限速步骤，各种各样的栖息地，包括土壤，淡水，海水柱，河口和沉积物，中的氨氧化细菌（AOB）已经受到相当大的关注。尽管AOB在远洋和底层海洋环境中具有关键的生物地球化学作用，但它们通常仅占细菌集合的0.1%。相反，来自古菌域的微生物普遍存在且通常在海洋中含量丰富，但它们的生化作用却仍不清楚。古生物代表着生命的第三领域，在进化上不同于真核生物和细菌，并且之前被认为大多居住在极端环境中。非嗜热古细菌（嗜泉古菌界和广域古菌界）现在被认为广泛分布在海洋中，但我们目前仍然无法确定它们的生理和生物地球化学功能。虽然因为能够摄取氨基酸，一些浮游古生菌可能是异养的，但有证据表明一些海洋古细菌也可能是化学自养型，能够进行光独立碳（C）固定。进一步了解浮游古生菌的潜在代谢能力可以参考Venter等人最近的工作，他们通过打乱DNA测序研究了马尾藻海的微生物基因组的多样性。基于他们在一个与古菌相关的支架上发现的一个独特的氨单加氧酶基因，Venter 等人认为一些古细菌可能能够进行化学自养性硝化。

amoA 编译了氨单加氧酶的催化亚基，该酶负责在细菌氨氧化中催化速率限制步骤。因为amoA具有很好的保守性并且是所有的AOB所必需的，所以该基因已被广泛地用作为独立培养AOB群研究的分子标记。一些古菌携带amoA的可能性被Schleper等人证实 ，他们在同一个43-kb宏基因组片段上发现了一个与来自土壤嗜泉古菌的16S rRNA基因类似的马尾藻海海式amoA同源物，表明能够氨氧化的古细菌可能存在于土壤中。这种新型的amoA和古细菌氨氧化之间的确定的联系，最近才通过培养海洋第一组的嗜泉古菌的氨氧化成员得以建立，而嗜泉古菌是来自这种优势古细菌谱系中的第一个栽培代表。氨氧化古菌（AOA）在海洋环境中的分布广泛程度，以及其在全球氮循环中的相对重要性仍然处于未知阶段。

在本研究中，我们使用特殊的PCR指示剂靶向古菌amoA，从而记录水柱和海洋沉积物中AOA的分布和多样性。

材料和方法

站点描述，样本收集和DNA提取

本文在黑海（2003年4月）的低压区和蒙特里湾（2005年4月）的两个站（指定为C1和M2），使用安装在水文线上的Niskin瓶，从三个深度收集次生亚硝酸盐最大值的水样（=15.7,15.8,15.9）。将水样品分别使用正压泵（黑海）或蠕动泵（蒙特里湾）直接过滤到Sterivex胶囊（0.2mu;M微孔过滤器）中。过滤后，将胶囊加盖，包装在聚丙烯袋中，在液氮中冷冻，并储存与-80℃环境下直至DNA提取。简而言之，DNA是从在55℃环境下温育2小时后的1.6ml裂解缓冲液（20mM EDTA/400mM NaCl/750mM蔗糖/50mM Tris），200mu;l10％的SDS以及 l00mu;l的蛋白酶K（10mg / ml）的混合液中提取的。加入1ml 100％的乙醇后，细胞裂解液将会用DNeasy柱（Qiagen公司，瓦伦西亚，加利福尼亚）进行纯化。

2003年11月，我们从墨西哥太平洋沿岸少氧区内的次生亚硝酸盐最大值处（200米深）收集10升水，过滤到一个SpiralCap胶囊里进行冷冻，并储存在-70℃以下的环境中。为了裂解，我们把12ml Tris EDTA / 1％的SDS和750mu;l的蛋白酶K（10mg / ml）加入到胶囊中，然后在55℃下培育2个小时。之后我们除去裂解物，将其置于冰上90分钟，并在17,000times;g的离心加速度下转40分钟以除去细胞碎片。 将DNA乙醇沉淀过夜，并在32,000times;g 环境下沉淀30分钟，使其重新悬于300mu;l的无菌水，并使用Qiagen DNeasy柱进一步纯化。

通过使用小型船舶部署的箱芯，我们分别在2004年7月和2004年10月在墨西哥（加利福尼亚湾）的旧金山湾和Bahıadel Tobari湾收集到表面沉积物。我们分别于2004年10月在埃尔克霍恩斯劳河河口（从头到口：哈德森源头、蜂鸟岛和维尔摩沼泽）的三个地点、2004年7月在亨廷顿海滩含水层的非限制冲浪区用手收集沉积物。至于土壤聚集体，我们选择在2004年6月从TN的Oak Ridge附近的未受污染的“背景”位点处的饱和C水平面收集。利用定点的5-毫升注射器，我们从每个不同背景下收集土壤核心，在干冰上冷冻，并储存在-80℃环境下。通过使用用于土壤的FastDNA SPIN试剂盒（Qbiogene，Carlsbad，CA），我们又从~0.25g的沉积物（0-0.5cm深度区间）或土壤中提取DNA。

PCR引物设计，扩增和克隆古菌amoA片段

基于来自马尾藻海（GenBank登录号AACY01435967）和德国土壤（GenBank登录号AJ627422）的古细菌amoA基因和推导的氨基酸序列的比对，我们设计了PCR引物。通过使用PCR引物Arch-amoAF（5- -STAATGGTCTGGCTTAGACG-3）和Arch-amoAR（5-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3），我们按以下方案扩增基因片段（635bp）：95℃5分钟; 30个循环，其由94℃45秒，53℃60秒和72℃60秒组成; 72℃15分钟。再将三次PCR合并（以使PCR偏差最小化），凝胶纯化，并用TOPO-TA克隆试剂盒（Invitrogen）进行克隆。同时我们将白色菌落转移到含有LB培养基（含有50mu;g/ ml卡那霉素）的96孔板中，在37℃下生长过夜，并利用T7和M13R载体引物直接将PCR筛选插入。

测序和系统发育，稀疏和统计分析

通过使用载体引物，T7 / M13 PCR产物的测序工作在Applied Biosystems 3730xl毛细管测序仪上不断进行。通过使用4.1版本的（Gene Codes，Ann Arbor，MI）SEQUENCHER，我们进行了核苷酸序列的组装和编辑。同时，我们选择377个古菌amoA序列的606bp区域用于系统发育分析，并利用MACCLADE将核苷酸和氨基酸进行比对（基于202个残基）（http：//macclade.org）。基于DNA序列（使用Jukes-Cantor校正的距离）和在PAUP * 4.0b10内的氨基酸序列的比对，我们构建了邻位连接进化树。Bootstrap分析被用来估计系统发生重建的可靠性（1,000个重复）。为了比较每个克隆库中古细菌amoA的丰富性，我们用DOTUR进行了稀疏分析和Chao1非参数丰度估计。其中可使用的分类单位（OTU）被定义为是序列中相差plusmn;2％或5％的序列组。

结果与讨论

泛型的AOA：非极端藻类曾在各种各样的环境中被检测到，并且在海洋中广泛存在; 然而，它们在海洋碳或氮循环中的作用仍然是一个谜。我们的研究结果表明，能够进行氨氧化的古生物在海水水柱和沉积物中普遍存在。通过使用我们的引物，我们对古细菌amoA基因进行了广泛的PCR调查，引起了从八个不同地理位置（蒙特利湾的水柱（正色区 ），东部热带北太平洋（ETNP; 少氧区）和黑海（低碳区）; 来自旧金山湾，埃尔克霍恩斯劳河和亨廷顿海滩（Huntington Beach，CA）和墨西哥Bahıadel Tobari的海岸和河口沉积物）内的多个位点或深度扩增635个碱基对的片段（对应于基本上整个基因）。同时，为了比较的目的，来自OakRidge，TN的饱和（低氧）土壤作为了标准样品。总而言之，我们从水柱、沉积物和土壤中产生了15个克隆库和377个古细菌amoA序列的数据库（图1）。

引物是针对来自德国土壤和马尾藻海海水柱的新古菌amoA序列设计的。这两组基因共享了76％的DNA，但在氨基酸水平上具有85％的同一性和91％的相似性。由于这些古细菌amoA基因是已知的细菌amoA基因的远端同系物 和细菌，我们不可能用amoA（或pmoA）的引物从背景DNA样品中回收它们。尽管我们的设计只是基于有限数量的可获得的序列，这些引物也回收了377个古细菌amoA序列，它们与德国土壤序列具有69％至96％的同一性，而与马尾藻海序列具有69％至99％的同一性。基于这个广泛的数据库，我们可以设计新的、更简并的引物，使它们能够捕获更大的古菌amoA多样性。

AOA的多样性：总的来说，我们从377个单个古菌amoA序列中回收了总共138个独特的OTUs（基于2％截断值）。观察到的和外推的AOA丰度在水柱和沉积物库中差异都很大（图2），其中Chao1丰度估计范围为水柱库的5至37个OUT而沉积物库则达到了11至48个OTUs（参见表1， 作为PNAS网站上的支持信息）。这些丰度水平与从水柱和沉积物获得的细菌amoA克隆观察到的丰度水平相当或较高些。基于PCR克隆库的系统发育分析，单个样品位置通常具有与其相关的独特的古菌amoAs序列（图1）; 然而，这些独特的AOA序列的进化枝根据不同的栖息地聚集方式也不同。例如，作为唯一的淡水站点、来自北旧金山湾（NB-1）的所有序列，将完全落入一个连贯的群集。类似地，从田纳西土壤中回收的所有amoA序列都落入一个大的，系统发育不同的簇中（参见图1中的土壤沉淀簇）。该簇还包括来自土壤宏基因组克隆54d9的amoA序列，其来源于在土壤中已知的最广泛分布的古细菌属谱系（组1.1b）的成员。有趣的是，尽管地理位置和生物地球化学特性不同，来自黑海，蒙特里湾和ETNP的142个水柱序列中的141个可以分为三个不同的簇（A，B和C;图1）。这些簇中最大的（簇A）含有大于70％的水柱序列，包括马尾藻海序列。有人推测这些水柱序列对应于严格的“浮游”AOA; 然而，来自埃尔克霍恩斯劳河沉积物的几个序列也落入这些进化枝中，并且与黑海和蒙特里湾的水柱序列具有超过99％的同一性（图1）。同时，许多沉积序列也落入土壤/泥沙簇中。如图1所示，尽管除了一个水柱序列外都落入水柱簇中且所有的土壤序列都落入大的土壤/沉积物簇中，这些簇中的序列并不仅仅只能从这些环境中发现。这一发现部分反映了从沉积物中回收的古细菌amoA序列的广泛范围，其中序列将落在整个系统发生树的大量簇中（图1）。

AOA水中的多样性：黑海，蒙特里湾和ETNP。基于在马尾藻海海表面水基因组库中的古菌amoA基因的鉴定，我们预期类似的基因将会存在于其他硝化过程起着重要作用的海水水柱环境中。黑海是世界上最大的缺氧海洋盆地，并且包括显著的低氧区（），而在这些低氧区中，氮循环（例如，反硝化，厌氧氧化）都是非常重要的。古细菌amoA从黑海低氧区的多个深度层开始增殖。有趣的是，该基因存在于那些已被报道的厌氧氨氧化细菌所处的类似的密度层中（T）。从黑海低氧区获得的古细菌amoA序列中的大多数（gt;88％）都落入簇A中，并显示与马尾藻海基因序列具有90-92％的核苷酸同一性。在该簇内，在DNA水平上有四个主要的序列类型相差度约为1-2％，且主要出现在第三位置 （在扩展的树中可见，图3，其在PNAS网站上被公布为支持信息）。剩余的黑海序列分为B和C群。总体而言，黑海克隆库在本研究中是最不同的（图2），而我们似乎已经恢复了Chao1富集预测的大部分或全部OTU 估计量（表1）。

来自蒙特里湾上层水柱中的以及与黑海序列密切相关的大多数序列都一起

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