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镁分子内激态质子转移的比例荧光探针

Narinder Singh , Navneet Kaur , Ray C. Mulrooney , John F. Callan,

摘要

研制了一种简单的用于pH=7的半水溶液中镁离子定量识别荧光传感器。该传感器是Schiff碱，通过激发态分子内质子转移（ESIPT）产生一个具有良好的镁离子结合能力的酮互变异构体。该传感器比其他金属离子（包括碱/碱土离子）显示出良好的选择性，可测量2.0到30.0um之间的Mg² 离子浓度。根据化学计量学建立为2:1（主体：客体），结合常数（K₂₁）为(1.4 plusmn; 0.1)*10⁴M。该传感器可用于检测高镁血症等疾病。

正文

镁是细胞内第二丰富的阳离子和体内第四丰富的阳离子。1在磷酸转移反应中作为辅酶发挥重要作用，在DNA合成中作为辅助因子，有助于调节信号转导。2硫酸镁目前用于治疗许多疾病，包括心律失常、心肌梗死和子痫。3它也正用于血管痉挛的康复治疗，这种并发症在蛛网膜下腔出血（SAH）患者中很常见，并可导致因脑缺血和梗塞而死亡。4每年在英国发生的11万例中风中，约5%是由蛛网膜下腔出血引起的。然而使用硫酸镁治疗血管痉挛导致的高镁血症可能是医源性的。5在极端情况下，高镁血症可导致心脏骤停，因此，简单、快速的检测方法具有明显的益处。

镁的有效检测需要一种灵敏度高、对镁离子选择性高于钙离子的方法，以及在水或半水介质中操作的能力。6荧光光谱因其灵敏度高、响应速度快、成本相对较低而在分子传感中继续发挥着重要作用。然而，大多数报告的镁离子荧光探针是非比例测量的，即，它们使用单波长工作。7由于该方法不存在与受体浓度、光漂白和环境影响有关的误差，因此比传统的单波长荧光识别具有优势。8已经报道了用于开发比率荧光传感器的各种策略。9传感器1b中的激发态分子内质子转移（ESIPT）过程可以提供双通道发射10以及酮互变异构体（2b）作为Mg ² 的有效受体（参见方案1）。7a–d

计划1 反应和条件:(i)干燥MeOH, 30分钟(i i);NaBH4, THF/MeOH, 5 h。

按照已知方法，分别使2-氨基苯硫酚和苯胺与2-羟基-1-萘甲醛在甲醇中反应，合成传感器1b和对照化合物1a。11通过THF/ MeOH溶剂系统中使用NaBH4还原1b来制备对照化合物3（参见补充数据）。

在THF / H2O（9：1，v / v）溶剂体系中的10mu;M1b溶液显示出在275nm激发时在kmax=355和427nm处具有双发射的荧光光谱（图1a）。这两个波段分别代表烯醇（1b）和酮（2b）的形式。通过添加特定金属盐时荧光强度的变化评估1b的阳离子识别行为。在向1b的溶液中加入25mu;M的Mg² 溶液时，在kmax=355nm处的发射带的强度随着在kmax=427nm处的带的伴随增加而降低。其他金属离子包括碱（Na 和K ），碱土（Ca² 和Sr² ）和过渡金属离子（Mn² ，Fe³ ，Co² ，Ni² ，Cu² 和Zn² ）显示在相同条件下，荧光光谱没有这种显著变化。相反，没有硫醇基团的对照化合物1a对Mg² 或除Cu² 和Fe³ 之外的任何其它金属离子没有表现出特别的结合亲和力（图S7，补充数据）。

图1 (a)传感器中1b荧光强度的变化（b）传感器1b在THF/ H2O (9:1,v/v)HEPES缓冲液(pH 7.0plusmn;0.1)中加入特定金属盐后的荧光比。(I-Io/Io) [1b] = 10uM, [金属盐] = 25uM.

类似地，还在与1b所用相同的条件下测试对照化合物3（还原的席夫碱）的阳离子选择性。受体3的荧光光谱未显示任何双重发射并且没有明显的Mg² 结合亲和力（图S8，补充数据）。这揭示了由于ESIPT机制，亚胺连接对于酮-烯醇互变异构体的操作的重要性，并且还确定了酮形式负责Mg² 的有效结合。加入50mu;M Mg² 之前和之后1b的紫外-可见光谱（图2）保持相对不变，说明1b在基态中不结合Mg² 并且需要激发产生Mg² 螯合酮互变异构体。1a的结合模式揭示了硫醇基团在Mg² 结合中的重要性。硫醇基通常被认为是一个软结合位点，一般被认为在与Mg² 等碱土金属离子的结合中起较小的作用，对1a进行分析的结果表明，它的包含是Mg² 与1b有效结合的必由之路。1b样品氧化为二硫化类似物，破坏了Mg² 的亲和力，进一步证实了这一点。因此， 1b在激发时有效结合Mg ² 所需的核心官能团是硫醇基团，亚胺键和羟基。

图2 在Mg2 存在下受体1b和1b的紫外-可见光谱[1b] = 10uM, [Mg2 ] = 25uM

我们还研究了1b对溶液pH变化的响应（图S9，补充数据）。在低pH下，kmax=355nm处的荧光强度增加，这很可能是由于sp2氮的孤对对光诱导电子转移(PET)被抑制所致。这种质子化消除了ESIPT的可能性，因此，在427nm处没有观察到任何变化。有趣的是，高pH值也会激活1b的荧光，但在kmax=345nm处。我们认为这是由于酚羟基的去质子化，否则会通过激发态与水的振动耦合导致激发态的非辐射衰变。12这种去质子化也消除了ESIPT的可能性，因此在427nm处没有观察到大的变化。然而，在中等pH值(pH 7.0)时，荧光强度仍然较低。因此，通过在HEPES缓冲液中工作，我们确保1b中的酚基保持质子化，并能进行有效的ESIPT。

图3a显示了Mg² 离子滴定后1b荧光光谱的变化。结果表明，在THF/H2O溶液中(9:1,v/v)， Mg² 离子连续加入1b溶液后，kmax=355nm处发射带强度减小，kmax=427nm处发射带强度开始迅速增大。其原因如下:在没有Mg² 的情况下，烯醇的形式与其酮互变异构物处于激发态平衡。当Mg² 与酮结合时，这种平衡被打破，而反应向产生更多酮互变异构物进行。因此，烯醇互变异构引起的强度降低，而Mg² 结合酮互变异构引起的强度增加。因此1b可用于Mg² 在2.0 ~ 30.0uM浓度范围内的选择性比值估计(图S10，补充数据)。13为了确定1b在其他重要生理离子存在时测量Mg² 离子的能力，进行了竞争性结合实验。图3b为Mg² 有无与Ca² 结合时的比值荧光强度对比图。结果表明，在等摩尔浓度的钙离子作用下，Mg² 的估算没有任何误差。

采用连续变异法测定受体1b与Mg² 的结合化学计量学。14图4显示了工作的游离的1 b的荧光强度和系统的强度与主体的摩尔分数{[H] / [H] [G])}的一系列解决方案,在主体和客体的总浓度是常数,与主体的摩尔分数不断变化。结果表明，形成了一种2:1(主客比)复合体。使用方程[G]tot=alpha;/2K21(1-alpha;)2[H]tot alpha;[H]tot,/2,[G]tot是客体总浓度, [H]tot是主体的总浓度, alpha;=（I-I0）I是在特定Mg² 浓度,Ii是无限Mg² 的浓度下的荧光强度,结合常数K21分别是1.4*104plusmn;0.1 M-2。15这一数值低于非线性曲线拟合的预期，可以解释为:Mg² 结合导致两个先前在溶液中游离的受体结合，不利于熵增反应的发生。16此外，Mg² 必须与酮烯醇互变异构过程竞争，才能与酮形成络合物。这些相互矛盾的过程可能导致缔合常数低于预期。

综上所述，我们开发了一种新型荧光传感器用于Mg² 的比色法测定。由ESIPT形成酮互变异构体对Mg² 识别至关重要，并提供了双发射，使比率测定成为可能。据我们所知，这是第一个报道的使用ESIPT的镁比率测量探头的例子。该探针不受钙离子的干扰，可为高镁血症提供一种简便、快速的检测方法。

致谢

作者感谢EPSRC和RGU提供的财政援助。他们也要感谢位于斯旺西的EPSRC国家质谱服务中心提供的准确的质量数据。

补充数据

与本文相关的补充数据(包括实验细节、光谱和图表)可在网上找到，doi:10.1016/j.tetlet.2008.09.052.

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